Bunky HEK293: Základný kameň moderného bunkového výskumu a biotechnológie
Bunky ľudských embryonálnych obličiek 293(HEK293) sú líniou ľudských embryonálnych obličiek, ktorá si získala širokú popularitu vo vedeckej komunite vďaka svojej univerzálnosti a užitočnosti v širokom spektre výskumných aplikácií. Táto bunková línia vznikla začiatkom 70. rokov 20. storočia a odvtedy sa používa na vývoj vakcín, výskum rakoviny, testovanie liekov a prenos signálov. Tento príspevok na blogu sa bude zaoberať všetkými aspektmi bunkovej línie HEK293 vrátane jej pôvodu, informácií o kultivácii, výhod a nevýhod, aplikácií a zdrojov.
Bunky HEK293: Hek293: všeobecné informácie a pôvod
Čo sú bunky HEK293?
Bunky HEK293 sú ľudskou embryonálnou bunkovou líniou obličiek odvodenou z obličkového tkaniva elektívne ukončeného ľudského embrya neznámeho rodičovstva. Bunky vytvoril holandský biológ Alex Van der Eb začiatkom 70. rokov 20. storočia. Neskôr ich výskumník Frank Graham imortalizoval prostredníctvom transformácie skráteným adenovírusom 5.
Spočiatku sa zdalo, že transformácia buniek je náročná. Po mnohých neustálych snahách však došlo k rastu buniek z izolovaného jediného transformovaného klonu [1]. Transfekcia bunky adenovírusom 5 viedla k začleneniu génov E1A a E1B do genómu bunky, čo zabraňuje bunkovej smrti a umožňuje hojnú produkciu proteínov. Pred imortalizáciou neboli bunky fetálnej obličky dostatočne charakterizované, takže ich presný typ buniek nie je známy.
Embryonálne obličky sa skladajú z endotelových, epitelových a fibroblastových buniek, takže bunky HEK 293 pravdepodobne patria k týmto bunkám. Produkty mRNA a génov však naznačujú, že ide o neurónové bunky. Je možné, že pridanie Ad5 zmenilo bunkový fenotyp a expresiu génov. Zábavný fakt: "293" v HEK293 sa vzťahuje na 293. experiment, ktorý vykonal Graham.
Zábavný fakt: "293" v HEK293 sa vzťahuje na 293. experiment, ktorý vykonal Graham.
Charakteristika buniek HEK293
- Morfológia
- Veľkosť buniek
- Genóm a ploidia (počet chromozómov)
Bunky HEK293 majú tvar, ktorý pripomína epitelové bunky. Embryonálne obličky sa skladajú najmä z fibroblastov, endotelových a epitelových buniek. Bunky 293 sa teda tvarom podobajú jednému z týchto typov buniek.
Veľkosť buniek HEK 293 sa pohybuje medzi 11 až 15 µm, čo môže byť ovplyvnené podmienkami kultivácie. V kultúre sa bunky môžu javiť ako sploštené, keď rastú na povrchu, alebo zaoblené v suspenzii. Bunky HEK 293 sú hypotriploidné a približne 30 % buniek HEK 293 má modálnu ploidiu 64 chromozómov, ale niektoré bunky majú ešte viac chromozómov. Bunky majú tiež tri kópie chromozómu X a 4-kilobázový pár fragmentu adenovírusu 5 integrovaný do chromozómu 19.
Porovnanie bunkovej línie HEK293 a HEK293T
Z rodičovských buniek HEK 293 bolo odvodených mnoho derivátov, napríklad bežné deriváty buniek 293 HEK293T a HEK293F. Bunky HEK293T sú jedným z najpoužívanejších derivátov a vznikli začlenením teplotne citlivého mutanta SV40 T-antigénu do pôvodného genómu buniek HEK 293. Expresia T-antigénu umožňuje replikáciu plazmidov s pôvodom replikácie SV40 pri transfekcii do buniek 293-T, čo vedie k zvýšenej produkcii rekombinantných proteínov [2]. Viac informácií o derivátoch bunkovej línie HEK vrátane ich vývoja a vlastností nájdete v tomto prehľadovom článku.
Základy kultivácie buniek HEK293: Krok za krokom
|
Podmienky |
Informácie |
|
Čas zdvojnásobenia populácie |
Čas zdvojenia bunkovej línie HEK293 sa pohybuje od 24 do 45 hodín, pričom priemer je 30 hodín. |
|
Adherentné alebo suspenzné kultúry |
Bunky HEK293 možno pestovať v adherentnej aj suspenznej forme. Adherentné bunky rastú ako monovrstvy, zatiaľ čo suspenzné kultúry rastú ako sféroidy. |
|
Hustota výsevu |
Počas rastovej fázy rozdeľte bunky pri 80 - 90 % konfluencii. Oddeľte bunky pomocou Accutase a nasaďte ich pri hustote 1 až 4 x 104 buniek/cm2. Pri hustote výsevu 1 x 104 buniek/cm2 sa konfluentná vrstva vytvorí za 4 dni. |
|
Rastové médium |
Pestujte v Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) s 2 mM L-glutamínom a 10 % fetálneho bovinného séra (FBS). Médium vymieňajte dvakrát týždenne. |
|
Rastové podmienky (teplota, CO2) |
Pre optimálny rast uchovávajte vo zvlhčenom inkubátore pri teplote 37 °C s prívodom 5 % CO2. |
|
Skladovanie |
Na dlhodobé uchovávanie skladujte v parnej alebo kvapalnej fáze tekutého dusíka. Vyhnite sa skladovaniu pri teplote -80 °C v mrazničke, pretože to môže ovplyvniť životaschopnosť buniek. |
|
Proces zmrazovania a médium |
Na čo najlepšie uchovanie použite metódu pomalého zmrazovania. Mrazte v mraziarenskom médiu CM-1 alebo CM-ACF, ktoré je k dispozícii v spoločnosti CLS. |
|
Postup rozmrazovania |
Zmrazené bunky rozmrazujte 1 - 2 minúty vo vodnom kúpeli pri 37 °C, kým nezostane malý ľadový chumáč. Suspenziu buniek preneste do centrifugačnej skúmavky, pridajte predohriate rastové médium a odstreďte, aby ste odstránili zložky zmrazovacieho média. Resuspendujte bunkovú peletu v čerstvom médiu a kultivujte pri optimálnych podmienkach. |
|
Úroveň biologickej bezpečnosti |
Bunky HEK293 vyžadujú manipuláciu na úrovni biologickej bezpečnosti 1. |
Nákup buniek HEK293 pre vaše objavy
Pre váš prelomový výskum zvážte naše bunky HEK293, známe svojou všestrannosťou v štúdiách génovej expresie a vývoji vakcín, a deriváty ako HEK293T, HEK293 suspenzne adaptované, HEK293T/17, AAV-293 a 2V6.11. Objavte viac a vylepšite svoje experimenty preskúmaním nášho sortimentu produktov tu.
Bunková línia HEK293 vo výskume a priemysle
Použitie buniek HEK293 je rozmanité a významné. Často sa používajú ako systém na expresiu a výrobu rekombinantných proteínov. Vzhľadom na ich ľudský pôvod je pravdepodobnejšie, že proteíny produkované v týchto bunkách budú podobné svojim prirodzeným ľudským náprotivkom, pokiaľ ide o štruktúru a funkciu, čo je rozhodujúce pre terapeutické aplikácie.
Okrem toho sa bunky HEK293 často používajú pri štúdiu funkcie a regulácie génov, pretože ľahko prijímajú cudziu DNA, čo z nich robí vynikajúci model na genetickú manipuláciu. Tieto bunky tiež zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri výrobe adenovírusových vektorov, ktoré sa používajú pri génovej terapii a vývoji vakcín vrátane rýchlej tvorby vakcín pre COVID-19.
Výroba vakcín a proteínov: Bunky HEK 293 sú vhodné na rozsiahlu výrobu proteínov a terapeutických vakcín. Bunková línia sa ďalej používa na generovanie vírusových vektorov, ako sú adeno asociované a adenovírusové vektory. Nedávno sa bunky HEK 293 používali na výrobu kľúčového rekombinantného proteínu, erytropoetínu (EPO).
Testovanie liekov: Bunky HEK293 sa často používajú na testovanie toxicity liečiv a prírodných produktov.
Výskum rakoviny: bunky 293 sú nádorové a kľúčové zmeny expresie génov môžu zhoršiť nádorové ochorenie v tejto bunkovej línii. Preto sa bunková línia 293 často používa v štúdiách rakoviny na pochopenie základných molekulárnych mechanizmov a vývoja liekov.
Transfekčné štúdie: Transfekcia je proces zavádzania nukleových kyselín do buniek a bunky HEK293 sú pre tento proces obzvlášť vhodné. Viac o tejto téme je vysvetlené nižšie.
Úloha HEK293 pri výrobe vakcín a proteínov
Pri výrobe vakcín boli bunky HEK293 nápomocné pri vývoji vakcín na báze adenovírusov. Ich schopnosť rásť v suspenzných kultúrach umožňuje škálovateľné procesy, ktoré sú kľúčové pri uspokojovaní globálnych požiadaviek na vakcíny. Okrem toho ich ľudský pôvod poskytuje výhodu oproti iným bunkovým líniám, pretože môžu vykonávať posttranslačné modifikácie podobné ľudským, čím sa zabezpečí biologická účinnosť vyrábaných vakcín.
Univerzálnosť buniek HEK293 sa rozširuje na výrobu komplexných proteínov vrátane monoklonálnych protilátok a biologicky podobných látok, ktoré sa používajú pri liečbe rakoviny, autoimunitných ochorení a iných stavov. Ich schopnosť presne skladať a modifikovať proteíny z nich robí preferovanú voľbu v odvetví výroby rekombinantných proteínov.
Prečo sa bunky HEK293 používajú na transfekciu?
Transfekcia je proces zavádzania nukleových kyselín do buniek a bunky HEK293 sú na tento proces obzvlášť vhodné. Existuje niekoľko dôvodov, prečo sa bunky HEK293 uprednostňujú na transfekciu:
- Vysoká účinnosť transfekcie: Bunky HEK293 majú vysokú mieru absorpcie cudzej DNA, čo možno pripísať ich schopnosti exprimovať určité vírusové gény, ktoré uľahčujú vstup DNA do bunky.
- Robustný rast: Tieto bunky rastú rýchlo a pomerne ľahko sa udržiavajú, čo je výhodné pri experimentoch, ktoré vyžadujú rýchle a spoľahlivé výsledky.
- Prispôsobivosť: Bunky HEK293 možno pestovať v rôznych podmienkach vrátane adherentných alebo suspenzných kultúr, vďaka čomu sú vhodné na rozsiahlu výrobu proteínov.
- Ľudská bunková línia: Hek293: Ako ľudská bunková línia poskytujú relevantnejší biologický kontext pre ľudskú biológiu, čo je dôležité najmä v terapeutickom výskume, kde reakcia v ľudských bunkách predpovedá výsledky in vivo.
- Univerzálnosť: Sú schopné produkovať proteíny s komplexnými posttranslačnými modifikáciami, čo je vlastnosť, ktorá je nevyhnutná pre funkčnosť mnohých proteínov, najmä terapeutických protilátok.
Protokol subkultúry HEK293
Potrebné činidlá
- 1X fyziologický roztok s fosfátovým tlmivým roztokom (PBS)
- 10 % trypsín-PBS
- Dulbeccovo modifikované médium Eagle (DMEM)
Postup
Príprava buniek
- Skontrolujte bunky HEK pod mikroskopom, aby ste sa uistili, že sú približne 90 % konfluentné.
- Vyčistite pracovisko pomocou aseptických techník a sterilizujte digestor pomocou UV svetla.
- Pracovný priestor utrite 70 % etanolom.
- Všetky činidlá predhrejte vo vodnom kúpeli s teplotou 37 °C.
Výpočet rozdelenej frakcie a množstva osiva
- Určite delenú frakciu, zvyčajne v pomere 1:5 až 1:20.
- Vypočítajte objem na pipetovanie pomocou vzorca: Vp = (S)(Vd).
Objemy médií a protokoly delenia
Pri kultivácii buniek si rôzne nádoby vyžadujú špecifické objemy médií a majú jedinečné rastové oblasti. Napríklad 6jamková platňa má rastovú plochu 4,67 cm^2 na jamku a potrebuje približne 2,5 ml média, zatiaľ čo 100 mm platňa má rastovú plochu 55 cm^2 a vyžaduje 10 ml média. Proces delenia buniek zahŕňa odstránenie starého média, premytie PBS, inkubáciu s Accutase, neutralizáciu s DMEM, odstredenie, opätovné rozpustenie v novom médiu a následné nasadenie na novú platňu. Podrobné kroky a pomery pre iné nádoby, ako sú 100 cm^2 banky a 150 mm platne, nájdete v pôvodnom zdroji.
Výhody a obmedzenia bunkovej línie HEK293
Bunky HEK293 majú charakteristické vlastnosti, ktoré ich robia atraktívnymi pre výskum a výrobu proteínov.
Výhody
- Vysoká produkcia rekombinantných proteínov: Bunky HEK293 môžu produkovať veľké množstvá rekombinantných proteínov s komplexnými posttranslačnými modifikáciami.
- Flexibilná transfekcia: Tieto bunky sú vysoko účinné pri transfekčných štúdiách a možno ich účinne transfekovať rôznymi fyzikálnymi a chemickými metódami.
- Analýza expresie génov: Vzhľadom na ich schopnosť účinnej transfekcie sa bunky HEK293 môžu používať na analýzu expresie prechodných aj stabilných génov.
- Reprodukovateľnosť výsledkov: Bunky HEK293 poskytujú konzistentné, spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky, vďaka čomu sú obľúbenou voľbou pre výskumné laboratóriá.
Nevýhody bunkovej línie HEK293
- Bakteriálna kontaminácia: Riziko bakteriálnej kontaminácie je bežným problémom pri kultivácii bunkových línií vrátane buniek HEK293. Bakteriálne infekcie môžu zmeniť pH kultivačného média, spôsobiť zákal a ovplyvniť tvar buniek, dobu kultivácie a expresiu génov. Aby sa zabránilo kontaminácii, musia sa prísne dodržiavať aseptické podmienky kultivácie buniek.
- Vírusová infekcia: Bunky HEK293 sú podobne ako iné ľudské bunkové línie náchylné na ľudské vírusové ochorenia. Tieto infekcie sa dajú zistiť len pomocou testov PCR a nie sú ľahko viditeľné.
- Doba kultivácie: Hoci je bunková línia HEK293 imortalizovaná, predĺžené obdobie kultivácie môže postupne zhoršiť zdravie buniek a ovplyvniť expresiu génov, reprodukovateľnosť a rast buniek. Na udržanie zdravej kultúry sa odporúča udržiavať počet pasáží pod 20.
Prehľad zdrojov HEK293: Prehľad protokolov, videí a ďalších informácií
Bunky HEK293 sú široko používanou a dobre preskúmanou bunkovou líniou, čo vedie k vzniku rôznych zdrojov na ich udržiavanie a kultiváciu. Tu upozorňujeme na niektoré zdroje, z ktorých sa dozviete o protokoloch kultivácie buniek HEK293:
- Delenie a údržba buniek HEK: HEK293: Vzdelávacia webová stránka s množstvom informácií o bunkách HEK293. Opisuje protokol subkultivácie a výsevu tejto bunkovej línie.
- Bunky HEK293: Tento odkaz na webovú stránku poskytne všetky zverejnené informácie týkajúce sa podmienok kultivácie buniek, rastových médií a protokolov delenia.
Videá týkajúce sa bunkovej línie HEK293
Ľahko dostupné sú mnohé vzdelávacie videá o subkultivácii, rozdeľovaní buniek a protokoloch transfekcie buniek HEK293.
- Tranzientná expresia pomocou buniek HEK 293: Toto vzdelávacie video opisuje základný koncept analýzy prechodnej expresie v bunkách HEK293 s ilustráciami.
- Delenie buniek HEK293: Toto video zobrazuje kompletný protokol subkultivácie bunkovej línie HEK293.
Odhaľte potenciál svojho výskumu s bunkami HEK293! Máme pre vás všetky informácie, ktoré potrebujete, aby ste mohli začať, tak prečo čakať? Urobte rozumné rozhodnutie a objednajte si u nás ešte dnes, aby ste si vyskúšali výhody používania tejto neuveriteľnej bunkovej línie vo svojej štúdii!
Často kladené otázky o bunkách HEK293
Bunky HEK293 sú predmetom širokého používania vo vedeckom výskume, čo prirodzene prináša množstvo otázok o ich povahe, pôvode a vlastnostiach. Nižšie uvádzame niektoré z týchto bežných otázok.
Referenčný zoznam
- Lin, Y.-C., et al., Genome dynamics of the human embryonic kidney 293 lineage in response to cell biology manipulation. Nature communications, 2014. 5(1): p. 4767.
- Tan, E., et al., HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors (Bunková línia HEK293 ako platforma na výrobu rekombinantných proteínov a vírusových vektorov). Frontiers in bioengineering and biotechnology, 2021: s. 1288.
- Pulix, M., et al., Molecular characterization of HEK293 cells as emerging versatile cell factories (Molekulárna charakteristika buniek HEK293 ako vznikajúcich univerzálnych bunkových tovární). Aktuálne názory v biotechnológii, 2021. 71: p. 18-24.
- Alvim, R. G., I. Itabaiana Jr. a L. R. Castilho, Zika virus-like particles (VLP): Stabilné bunkové línie a kontinuálne perfúzne procesy ako nová potenciálna platforma na výrobu vakcín. Vaccine, 2019. 37(47): p. 6970-6977.
- Schwarz, H., et al. bioreaktor malého rozsahu podporuje perfúznu kultúru buniek HEK293 s vysokou hustotou na výrobu rekombinantného erytropoetínu. Journal of biotechnology, 2020. 309: p. 44-52.
- Liu, X., et al. nanotoxické účinky nanočastíc striebra na normálne bunky HEK-293 v porovnaní s rakovinovou bunkovou líniou HeLa. International journal of nanomedicine, 2021. 16: p. 753.
- Patra, B., et al., Piper betle: augmented synthesis of gold nanoparticles and its in-vitro cytotoxicity assessment on HeLa and HEK293 cells (Piper betle: rozšírená syntéza zlatých nanočastíc a ich hodnotenie cytotoxicity in vitro na bunkách HeLa a HEK293). Journal of Cluster Science, 2020. 31: p. 133-145.
- Stepanenko, A. a V. Dmitrenko, HEK293 in cell biology and cancer research: phenotype, karyotype, tumorigenicity, and stress-induced genome-phenotype evolution (HEK293 v bunkovej biológii a výskume rakoviny: fenotyp, karyotyp, nádorovosť a evolúcia genómu vyvolaná stresom). Gene, 2015. 569(2): p. 182-190.