Uverejnené: 2023 | Posledná aktualizácia: máj 2026
Komplexný sprievodca zmrazovaním buniek: Zabezpečenie životaschopnosti a sterility
Mrazenie buniek je kľúčovým procesom v riadení bunkových kultúr, ktorý zabezpečuje dlhodobé skladovanie a uchovanie cenných bunkových línií. Nech už pracujete s ľudskými alebo zvieracími bunkami, dodržiavanie presných protokolov a prísnych aseptických postupov je nevyhnutné na dosiahnutie úspešnej kryokonzervácie.
Táto príručka poskytuje podrobné pokyny týkajúce sa potrebných materiálov, reagentov a postupov krok za krokom na efektívne zmrazenie buniek pri zachovaní ich životaschopnosti a sterility. Dodržiavaním týchto usmernení môžu výskumníci s istotou skladovať a neskôr oživiť bunkové kultúry s minimálnou stratou životaschopnosti buniek, čím zachovajú integritu a spoľahlivosť svojich experimentálnych výsledkov.
Na začiatok je nevyhnutné vytvoriť sterilné pracovné prostredie. Správne aseptické postupy hrajú kľúčovú úlohu pri prevencii kontaminácie a zabezpečení sterility kultúr.
Aseptická technika
Počas celého procesu dodržiavajte aseptické techniky, aby ste zabezpečili sterilitu kultúr.
Komplexný proces zmrazenia buniek
Tento diagram poskytuje podrobný vizuálny návod na základné kroky potrebné na správne zmrazenie buniek. Dodržiavajte tieto postupy, aby ste zabezpečili vysokú životaschopnosť a integritu buniek počas procesu kryokonzervácie.
Príprava mraziaceho média
Pripravte kryoprotektívne mraziace médium podľa typu buniek:
- Kultúry v médiách obsahujúcich FBS: 90 % FBS + 10 % DMSO alebo 70 % rastového média, 20 % FBS a 10 % DMSO
- Bunky vyžadujúce glycerol: 90 % FBS + 10 % glycerolu
Zvážte zakúpenie nášho vopred namiešaného mraziaceho média:
- Mrazové médium CM-1: Pre protokoly vyžadujúce médium obsahujúce fetálne bovinné sérum (FBS)
- Mrazové médium CM-ACF – bez séra: Ako alternatíva bez FBS
Označovanie a dokumentácia
Označte kryovialky nasledujúcimi údajmi:
- Dátum
- Meno výskumníka
- Číslo buniek
- Číslo pasáže
- Typ buniek
- Ďalšie informácie (napr. genetické modifikácie)
Príprava buniek
Pre adhezívne bunky:
- Sledujte bunky, kým nedosiahnu 85–95 % konfluencie
- Odstráňte staré kultivačné médium
- Prepláchnite monovrstvu buniek PBS bez vápnika a horčíka
- Oddelenie buniek pomocou Accutase, trypsínu alebo trypsínu-EDTA a v prípade potreby neutralizácia kultivačným médiom
- Preneste bunkovú suspenziu do 50 ml Falconovej skúmavky
Pre bunky v suspenzii:
- Skontrolujte hustotu a zdravotný stav buniek pod mikroskopom
- Preneste bunkovú suspenziu priamo do 50 ml Falconovej skúmavky
Počítanie buniek a centrifugácia
- Počítajte bunky pomocou hemocytometra alebo automatického počítača buniek
- Centrifugujte pri 300 g počas 3–5 minút pri izbovej teplote, aby sa bunky usadili
- Opatrne odsajte supernatant, aby ste nenarušili zrazeninu buniek
- Pred použitím zahrejte pripravené mraziace médium na 37 °C
Kryokonzervácia
- Resuspendujte bunky v mraziacom médiu na hustotu 2,0 milióna buniek/ml pre adhezívne bunky a 5 miliónov buniek/ml pre suspenzné bunky, alebo na požadovanú koncentráciu
- Odmerajte 1,0 ml (alebo viac podľa potreby) bunkovej suspenzie do označených kryovialiek
- Pred presunom buniek do dlhodobého skladovania použite metódu pomalého zmrazovania
- ? Metóda
- ? Kroky
-
❄️
Ručné zmrazenie -
1️⃣ Umístite bunky v mraziacom médiu do mrazničky s teplotou 4 °C na 40 minút.
2️⃣ Preneste do mrazničky s teplotou -80 °C na 24 hodín.
3️⃣ Bunky uchovávajte v tekutom dusíku na dlhodobé uchovanie. -
?
Použitie Mr. Frosty -
1️⃣ Pripravte bunky v kryovialách s mraziacim médiom.
2️⃣ Vložte kryovialy do kontajnera Mr. Frosty.
3️⃣ Skladujte pri teplote -80 °C po dobu 24 hodín pred presunutím do tekutého dusíka. -
?
Mraznička s regulovanou rýchlosťou -
1️⃣ Naprogramujte zariadenie tak, aby postupne znižovalo teplotu.
2️⃣ Vložte pripravené bunky do mrazničky.
3️⃣ Po ukončení mraziaceho cyklu preneste bunky do tekutého dusíka.
- Kryovialky skladujte pri teplotách pod -130 °C alebo v tekutom dusíku na dlhodobé uchovávanie.
Materiály a reagencie
- 1–2 ml kryovialy
- Mraziaca jednotka CoolCell® alebo mraznička s regulovanou rýchlosťou
- Kryoprotektívne mraziace médium (napr. DIY kryoprotektívne médiá, CM-1, CM-ACF alebo špecializované médiá)
- Fetálne bovinné sérum (FBS) alebo kondicionované médiá
- DMSO alebo glycerol
- PBS bez vápnika a horčíka
- Accutase, trypsín alebo trypsín-EDTA (pre adhezívne bunky)
- 15 ml alebo 50 ml Falconove skúmavky
- Hemocytometer alebo automatický počítač buniek
- Centrifúga