Komplexný sprievodca zmrazovaním buniek: Zabezpečenie životaschopnosti a sterility
Zmrazovanie buniek je kritickým procesom pri správe bunkových kultúr, ktorý zabezpečuje dlhodobé skladovanie a uchovávanie cenných bunkových línií. Či už pracujete s ľudskými alebo živočíšnymi bunkami, dodržiavanie presných protokolov a prísnych aseptických techník je prvoradé na dosiahnutie úspešnej kryokonzervácie.
Táto príručka poskytuje podrobné pokyny o potrebných materiáloch, činidlách a postupoch krok za krokom na účinné zmrazenie buniek pri zachovaní ich životaschopnosti a sterility. Dodržiavaním týchto pokynov môžu výskumní pracovníci bez obáv skladovať a neskôr oživovať bunkové kultúry s minimálnou stratou životaschopnosti buniek, čím sa zachová integrita a spoľahlivosť ich experimentálnych výsledkov.
Na začiatku je nevyhnutné vytvoriť sterilné pracovné prostredie. Správne aseptické techniky zohrávajú kľúčovú úlohu pri prevencii kontaminácie a zabezpečení sterility kultúr.
Aseptická technika
Počas celého procesu dodržiavajte aseptické techniky, aby ste zabezpečili sterilitu kultúr.
Komplexný proces zmrazovania buniek
Tento vývojový diagram poskytuje podrobného vizuálneho sprievodcu základnými krokmi, ktoré sa podieľajú na správnom zmrazovaní buniek. Dodržiavajte tieto postupy, aby ste zabezpečili vysokú životaschopnosť a integritu buniek počas procesu kryokonzervácie.
Príprava zmrazovacieho média
Pripravte kryoprotektívne zmrazovacie médium podľa typu buniek:
- Kultivačné médiá obsahujúce FBS: fBS + 10 % DMSO alebo 70 % rastového média, 20 % FBS a 10 % DMSO
- Bunky vyžadujúce glycerol: 90 % FBS + 10 % glycerolu
Zvážte možnosť zaobstarať si naše vopred pripravené zmrazovacie médium:
- Mraziace médium CM-1: pre protokoly vyžadujúce médium obsahujúce fetálne hovädzie sérum (FBS)
- Mraziace médium CM-ACF - bez séra: Pre alternatívu bez FBS
Označovanie a dokumentácia
Kryovílie označte týmito údajmi:
- Dátum
- Meno výskumníka
- Číslo bunky
- Číslo pasáže
- Typ bunky
- Akékoľvek ďalšie informácie (napr. genetické modifikácie)
Príprava buniek
Pre adherentné bunky:
- Sledovanie buniek, kým nedosiahnu 85-95 % konfluenciu
- Aspirujte staré kultivačné médium
- Prepláchnite monovrstvu buniek PBS bez vápnika a horčíka
- Oddeľte bunky pomocou akutázy, trypsínu alebo trypsínu-EDTA a v prípade potreby ich neutralizujte kultivačným médiom
- Preneste bunkovú suspenziu do 50 ml Falconovej skúmavky
Pre suspenzné bunky:
- Skontrolujte hustotu a stav buniek pod mikroskopom
- Preneste bunkovú suspenziu priamo do 50 ml skúmavky Falcon
Počítanie buniek a centrifugácia
- Spočítajte bunky pomocou hemocytometra alebo automatického počítadla buniek
- Odstreďujte pri 300 g počas 3 - 5 minút pri izbovej teplote, aby sa bunky peletizovali
- Opatrne odsajte supernatant, aby nedošlo k narušeniu bunkovej pelety
- Pred použitím zohrejte pripravené zmrazovacie médium na 37 °C
Kryokonzervácia
- Resuspendujte bunkové pelety v zmrazovacom médiu na hustotu 2,0 milióna buniek/ml pre adherentné bunky a 5 miliónov buniek/ml pre suspenzné bunky alebo na požadovanú koncentráciu
- Alikvotujte 1,0 ml (alebo viac podľa potreby) bunkovej suspenzie do označených kryovínií
- Pred prenosom buniek na dlhodobé skladovanie použite metódu pomalého zmrazovania
| ? Metóda | ? Kroky |
|---|---|
|
❄️ Ručné zmrazenie |
1️⃣ Umiestnite bunky do zmrazovacieho média do mrazničky s teplotou 4 °C na 40 minút. 2️⃣ Preneste do mrazničky s teplotou -80 °C na 24 hodín. 3️⃣ Na dlhodobé uchovanie uchovávajte bunky v tekutom dusíku |
|
? Použitie pána Frostyho |
1️⃣ Pripravte bunky v kryovíniách s mraziacim médiom. 2️⃣ Umiestnite kryovílie do nádoby Mr. Frosty. 3️⃣ Pred prenesením do tekutého dusíka uchovávajte pri teplote -80 °C po dobu 24 hodín |
|
? Mraznička s riadenou rýchlosťou |
1️⃣ Naprogramujte zariadenie na postupné znižovanie teploty. 2️⃣ Umiestnite pripravené bunky do mrazničky. 3️⃣ Po ukončení zmrazovacieho cyklu preneste bunky do tekutého dusíka |
- Kryovílie skladujte pri teplote nižšej ako -130 °C alebo v tekutom dusíku na dlhodobé uchovávanie.
Materiály a činidlá
- 1 - 2 ml kryovílie
- Mraziaca jednotka CoolCell® alebo mraznička s riadenou rýchlosťou
- Kryoprotektívne zmrazovacie médium (napr. kryoprotektívne médium DIY, CM-1, CM-ACF alebo špecializované médium)
- Fetálne hovädzie sérum (FBS) alebo kondicionované médium
- DMSO alebo glycerol
- PBS bez vápnika a horčíka
- Akutáza, trypsín alebo trypsín-EDTA (pre adherentné bunky)
- 15 ml alebo 50 ml skúmavky Falcon
- Hemocytometer alebo automatický počítač buniek
- Centrifúga