Techniky disociácie bunkových kultúr

Disociácia bunkových kultúr je kritickým krokom pri udržiavaní bunkových kultúr. Zahŕňa oddelenie buniek od ich rastového povrchu s cieľom umožniť subkultiváciu alebo zber. V tejto časti sú opísané dve hlavné metódy: použitie disociačných pufrov bez enzýmov a použitie enzymatických činidiel.

1.používanie bezenzymatických pufrov na disociáciu buniek

Táto metóda je šetrná a zachováva bunkovú integritu bez použitia enzýmov:

1. Príprava
   • Pred použitím sa uistite, že všetky činidlá sú zahriate na 37 °C, aby sa zabránilo šoku buniek.
2. Odstránenie rastového média
   • Staré rastové médium z kultivačnej nádoby vyhoďte.
3. Oplachovanie
   • Prepláchnite monovrstvy buniek 5 ml PBS bez vápnika a horčíka na banku T75 alebo 100 mm misku.
   • Nádobu jemne rozhýbte na 30 až 60 sekúnd pri izbovej teplote.
   • Oplachovací roztok odsajte a zlikvidujte.
   • Tento krok oplachovania zopakujte ešte raz.
4. Disociácia
   • Do nádoby pridajte približne 5 ml disociačného pufru bez enzýmov.
   • Jemne hýbte pri izbovej teplote 1 až 2 minúty a skontrolujte disociáciu pod mikroskopom.
   • V prípade potreby poklepte banku alebo misku o ruku, aby sa bunky uvoľnili.
   • Ak sú bunky prilepené, nechajte ich pri izbovej teplote ďalšie 2 až 5 minút a v prípade potreby s nimi opäť poklepte, pričom použite viac disociačného pufru.
   • Keď sú bunky oddelené, pridajte aspoň 5 ml kompletného rastového média na neutralizáciu disociačného pufru a bunky znovu suspendujte.
5. Kontrola životaschopnosti
   • Počas subkultivácie sledujte životaschopnosť buniek a zabezpečte, aby zostala nad 90 %.

2.použitie iných činidiel na disociáciu

Táto metóda umožňuje použitie rôznych disociačných činidiel:

1. Odstránenie použitého média
   • Staré médium z kultivačnej nádoby vyhoďte.
2. Premývanie buniek
   • Premyte bunky vyváženým roztokom soli bez vápnika a horčíka alebo použite EDTA.
   • Premývací roztok jemne pridajte na stranu oproti bunkám a pred vyliatím premývacieho roztoku nádobu 1 až 2 minúty pohupujte.
3. Disociácia
   • Naneste 2 až 3 ml zvoleného disociačného roztoku na 25 cm² rastového povrchu, pričom zabezpečte pokrytie bunkového listu.
   • Inkubujte nádobu pri teplote 37 °C a jemne ju rozkmitajte. Disociácia sa zvyčajne uskutoční v priebehu 5 až 15 minút v závislosti od bunkovej línie.
   • V prípade tvrdohlavých buniek môže poklepanie na nádobu proces urýchliť.
   • Bunky pozorne sledujte, aby ste zabránili nadmernému vystaveniu a možnému poškodeniu.
4. Zber buniek
   • Po úplnom oddelení buniek ich nechajte zhromaždiť na dne nádoby tak, že ju postavíte do zvislej polohy.
   • Pridajte kompletné médium, potom rozptýľte a zozbierajte bunky pipetovaním nad vrstvou buniek.
   • Spočítajte ich a pokračujte v subkultivácii.

Pri oboch metódach je dôležité určiť optimálne podmienky pre každú bunkovú líniu empirickým pozorovaním. Postup by mal zachovať životaschopnosť buniek, ktorá by sa mala počas subkultivácie rutinne kontrolovať tak, aby presahovala 90 %. Tieto postupy poskytujú výskumníkom základ, ktorý si môžu prispôsobiť na základe špecifických požiadaviek a vlastností svojich bunkových línií.

3.prehľad techník subkultivácie adherentných buniek

Účinná subkultivácia adherentných buniek si vyžaduje ich oddelenie od kultivačnej nádoby. Používajú sa rôzne metódy, z ktorých každá je vhodná pre rôzne typy buniek a podmienky. Pri výbere metódy oddeľovania je nevyhnutné zvážiť špecifické potreby bunkovej línie a ciele experimentu. Pravidelné monitorovanie životaschopnosti buniek, pričom cieľom je dosiahnuť viac ako 90 % v čase subkultivácie, je nevyhnutné pre zachovanie zdravia a produktivity kultúry. Tu je prehľad týchto postupov: