Uverejnené: 2023 | Posledná aktualizácia: máj 2026

Techniky disociácie bunkových kultúr

Disociácia buniek v kultúre je kľúčovým krokom pri udržiavaní buniek v kultúre. Zahŕňa oddelenie buniek od povrchu, na ktorom rastú, aby bolo možné ich subkultivovať alebo zozbierať. V tejto časti sú uvedené dve hlavné metódy: použitie pufrov na disociáciu bez enzýmov a použitie enzýmových reagencií.

Použitie pufrov na disociáciu buniek bez enzýmov

Táto metóda je šetrná a zachováva integritu buniek bez použitia enzýmov:

1. Príprava
   • Pred použitím sa uistite, že všetky reagencie sú zahriate na 37 °C, aby nedošlo k šoku buniek.
2. Odstránenie rastového média:
   • Vylejte staré rastové médium z kultivačnej nádoby.
3. Oplachovanie
   • Monovrstvy buniek prepláchnite 5 ml PBS bez vápnika a horčíka na jednu T75 fľašu alebo 100 mm misku.
   • Nádobu jemne potriasajte 30 až 60 sekúnd pri izbovej teplote.
   • Odsajte a zlikvidujte oplachovací roztok.
   • Tento krok oplachovania zopakujte ešte raz.
4. Disociácia
   • Do nádoby pridajte približne 5 ml pufru na disociáciu buniek bez enzýmov.
   • Jemne potriasajte pri izbovej teplote 1 až 2 minúty a skontrolujte disociáciu pod mikroskopom.
   • V prípade potreby poklepte na banku alebo misku o ruku, aby sa bunky uvoľnili.
   • Ak sú bunky prilnuté, nechajte ich odstáť pri izbovej teplote ďalších 2 až 5 minút a v prípade potreby opäť poklepte, pričom použite viac disociačného pufru.
   • Akonáhle sa bunky uvoľnia, pridajte aspoň 5 ml kompletného rastového média, aby ste neutralizovali disociačný pufr a bunky resuspendovali.
5. Kontrola životaschopnosti
   • Počas subkultivácie sledujte životaschopnosť buniek a zabezpečte, aby zostala nad 90 %.

Použitie iných činidiel na disociáciu

Táto metóda umožňuje použitie rôznych disociačných činidiel:

1. Odstránenie použitého média
   • Staré médium z kultivačnej nádoby zlikvidujte.
2. Pranie buniek
   • Bunky premyte vyváženým soľným roztokom bez obsahu vápnika a horčíka alebo použite EDTA.
   • Opatrne pridajte premyvací roztok na stranu opačnú k bunkám a nádobu 1 až 2 minúty potriasajte, potom premyvací roztok vyhoďte.
3. Disociácia
   • Na 25 cm² rastovej plochy naneste 2 až 3 ml zvoleného disociačného roztoku a zabezpečte pokrytie buneckej vrstvy.
   • Nádobu inkubujte pri 37 °C a jemne ňou potriasajte. Disociácia zvyčajne prebieha v priebehu 5 až 15 minút, v závislosti od buneckej línie.
   • V prípade odolných buniek môže proces urýchliť poklepávanie na nádobu.
   • Pozorne sledujte bunky, aby ste predišli nadmernému pôsobeniu a potenciálnemu poškodeniu.
4. Zber buniek
   • Akonáhle sa bunky úplne oddelia, nechajte ich usadiť sa na dne nádoby tak, že ju postavíte do vertikálnej polohy.
   • Pridajte kompletné médium, potom bunky rozptýľte a zberte pipetovaním nad bunkovou vrstvou.
   • Zrátajte bunky a pokračujte v subkultivácii.

Pri oboch metódach je dôležité určiť optimálne podmienky pre každú bunkovú líniu prostredníctvom empirického pozorovania. Proces by mal zachovať životaschopnosť buniek, ktorá by sa mala počas subkultivácie rutinne kontrolovať, aby presahovala 90 %. Tieto postupy poskytujú výskumníkom základ, ktorý môžu prispôsobiť na základe špecifických požiadaviek a charakteristík ich bunkových línií.

Prehľad techník subkultivácie adhezívnych buniek

Účinné subkultivovanie adhezívnych buniek vyžaduje ich oddelenie od kultivačnej nádoby. Používajú sa rôzne metódy, z ktorých každá je vhodná pre iné typy buniek a podmienky. Pri výbere metódy disociácie je dôležité zohľadniť špecifické potreby buneckej línie a ciele experimentu. Pravidelné monitorovanie životaschopnosti buniek s cieľom dosiahnuť viac ako 90 % v čase subkultivácie je nevyhnutné pre zachovanie zdravia a produktivity kultúry. Tu je prehľad týchto postupov: