Bunky HuH7: Brána k výskumu hepatómu a HCV

Bunka HuH7, odvodená z ľudského hepatómu, predstavuje imortalizovanú zbierku tumorigenických epitelových buniek. Táto bunka, spolu s jej derivátmi HuH7.5 a HuH7.5.1, slúži ako praktický náhradný model primárnych hepatocytov v experimentálnych podmienkach. Používa sa prevažne v modeloch bunkových kultúr na skúmanie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) a patofyziológie hepatómu.

Pôvod a charakteristiky buniek HuH7

Pred použitím buniek HuH7 vo výskume je nevyhnutné porozumieť ich pôvodu, kľúčovým vlastnostiam a optimálnym podmienkam kultivácie.

Bunka HuH7 bola založená Sato, J, a Nakabayshi, H v roku 1982 a pochádza z vysoko diferencovanej línie rakoviny hepatocytov. Pôvodne bola získaná z hepatocelulárneho karcinómu u 57-ročného japonského muža. Bunky HuH7, ktoré sa vyznačujú schopnosťou produkovať rôzne fyziologicky relevantné látky, ako je albumín a alfa-fetoproteín, vykazujú vysokú náchylnosť na infekciu HCV, čo ich predurčuje na použitie v replikónových systémoch HCV. Táto vlastnosť robí túto bunkovú líniu cennou pre skríning a vývoj liekov proti HCV. Bunky HuH7 vykazujú epiteliálnu morfológiu s hexagonálnym tvarom a pri raste sa priľnú k povrchom, čím vytvárajú 2D monovrstvy. V priemere majú bunky HuH7 priemer 21,9 µm a vyznačujú sa väčším, splošteným vzhľadom. Bunková línia HuH7 sa vyznačuje heterogénnym počtom chromozómov, ktorý sa zvyčajne pohybuje v rozmedzí 55 až 63, čo odzrkadľuje genetickú variabilitu v rámci buneckej populácie. Táto heterogenita je dôsledkom selektívneho tlaku, ktorému sú bunky vystavené počas kultivácie, a môže sa líšiť v závislosti od laboratórnych podmienok.

Porovnávacia analýza: bunkové línie HuH7 vs. HuH7.5

Bunka HuH7.5, derivát bunky HuH7, sa odlišuje predovšetkým v dôsledku missense mutácie v géne RIG-I (DDX58), ktorý je kľúčový pre intracelulárnu antivírusovú odpoveď. Táto mutácia zvyšuje priepustnosť buniek HuH7.5 pre replikáciu genomovej a subgenomovej HCV RNA, čím sa odlišuje od materskej bunky HuH7 z hľadiska jej využiteľnosti vo virologickom výskume.

Kultivácia buniek HuH7: Základné postupy pre optimálny rast

Bunky HuH7, ktoré sú neoddeliteľnou súčasťou nespočetných výskumných štúdií, vyžadujú na svoj rast presné kultivačné podmienky. Táto časť sa zaoberá základnými aspektmi kultivácie buniek HuH7, čím sa zabezpečuje zachovanie ich fyziologickej relevantnosti vo vedeckých výskumoch.

Dynamika doby zdvojnásobenia

Doba zdvojnásobenia buniek HuH7 je zvyčajne 24 hodín, hoci rozdiely v kultivačných médiách môžu túto dobu predĺžiť na 36–48 hodín, čo poukazuje na vplyv podmienok prostredia na bunkovú proliferáciu.

Adhézne vlastnosti

Bunky HuH7 tvoria prevažne dvojrozmernú monovrstvu, ktorá priľne k povrchom kultivačných platní a fliaš, čo podčiarkuje ich preferenciu stabilného fyzického substrátu pred suspenznými kultúrami.

Optimálna hustota výsevu

Udržanie konfluencie buniek HuH7 v rozmedzí 30–90 % je kľúčové na zabránenie poklesu rýchlosti proliferácie pri konfluencii nad 90 %. Subkultivácia s použitím accutase uľahčuje oddelenie buniek, čo umožňuje výsev v hustotách prispôsobených experimentálnym potrebám, od optimálnej (2×10⁴ buniek/cm²) až po saturáciu (6×10⁴ buniek/cm²).

Nutričné požiadavky

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) s vysokým obsahom glukózy a doplnené 10 % fetálnym bovinným sérom (FBS) poskytuje ideálne nutričné prostredie pre bunky HuH7. Pravidelná obnova média, ideálne 2–3-krát týždenne, je kľúčová pre udržanie zdravia buniek.

Podmienky prostredia

Zvlhčený inkubátor nastavený na 5 % CO₂ a 37 °C optimálne podporuje kultiváciu buniek HuH7 a simuluje fyziologické podmienky priaznivé pre bunkové aktivity.

Dlhodobé skladovanie

Pre dlhodobé uchovávanie by mali byť bunky HuH7 skladované vo fáze pary tekutého dusíka, čím sa zabezpečí ich životaschopnosť pre budúci výskum.

Kryokonzervácia a obnova

Použitie techniky postupného zmrazovania je kľúčové pre zachovanie životaschopnosti buniek počas kryokonzervácie. Bunky by mali byť suspendované v špeciálne navrhnutom zmrazovacom médiu, ako je CM-1, čím sa zabezpečí hladký prechod do kryogénneho skladovania. Po rozmrazení je pre obnovenie bunkových kultúr nevyhnutné rýchle, ale šetrné oživenie vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C, nasledované centrifugáciou na odstránenie mraziaceho média a resuspendovaním v čerstvom rastovom médiu.

Úvahy o biologickej bezpečnosti

Pri manipulácii a rozmnožovaní buniek línie HuH7 sa odporúča dodržiavať protokol biologickej bezpečnosti úrovne 1, ktorý je v súlade s bezpečnostnými a etickými normami v laboratórnych podmienkach.

Dodržiavaním týchto starostlivo stanovených podmienok kultivácie môžu výskumníci zabezpečiť robustný rast a fyziologickú relevantnosť buniek HuH7 vo svojich vedeckých výskumoch, čím pripravia pôdu pre prelomové objavy vo výskume hepatómu a vírusu hepatitídy C.

Objavte bunky HuH7 a dosiahnite svoje vedecké prelomy

Bunky HuH7: Výhody a nevýhody

Bunka HuH7 má svoje výhody aj obmedzenia. Pozrime sa na potenciálne klady a zápory tejto bunky, čo vám môže pomôcť rozhodnúť sa, či je vhodná pre vaše experimenty.

Výhody buneckej línie HuH7

Bunky HuH7 majú mnoho charakteristických vlastností, ktoré ich robia atraktívnymi pre výskumné účely.

• Ľahké rozmnožovanie: Na rozdiel od iných ľudských hepatómových bunkových línií sa bunková línia HuH7 dá ľahko kultivovať bez pridania séra; CLS však odporúča používať RPMI 1640 s 10 % FBS a 2 mM L-glutamínom. Bunky HuH-7 vylučujú rastový faktor, ktorý pomáha bunkám rásť bez séra.
• Flexibilita transfekcie: Bunková línia HuH7 sa široko používa na transfekčné účely vďaka svojej vysokej vnímavosti voči genómu HCV. Tieto bunky sú preto kľúčové pre skríning a vývoj liekov proti HCV.
• Alternatíva k ľudským hepatocytom: Bunková línia HuH7 je vynikajúcou náhradou za ľudské hepatocyty. Môže pomôcť výskumníkom pri štúdiu pečeňových transportérov liekov a pri pochopení interakcie určitých liekov s MRP (proteínmi asociovanými s multirezistenciou).
• Vývoj myšieho modelu s xenotransplantátom: Bunky HuH7 sa používajú na vytvorenie myšieho modelu s xenotransplantátom pochádzajúcim z buniek tejto bunky. Tento zvierací model môže výskumníkom poskytnúť cenné poznatky o inhibítoroch proteínkináz a protinádorových terapiách.
• Výskum rakoviny: Bunková línia HuH7 je bunková línia ľudských pečeňových rakovinových buniek, ktorá pomáha výskumníkom pri štúdiu rakoviny pečene.

Obmedzenia buneckej línie HuH-7

S kultiváciou buniek línie HuH7 sú spojené niektoré obmedzenia.

Mikrobiálna kontaminácia: Bakteriálna kontaminácia je najčastejším problémom v bunkovej kultúre. Keď dôjde k infekcii, dá sa to rozoznať podľa zmeny pH a zákalu kultivačného média. Spomedzi bakteriálnych kontaminácií nie je kontaminácia mykoplazmami zvyčajne zrejmá. Pomaly však ovplyvňuje morfológiu, génovú expresiu a ďalšie charakteristiky bunkovej línie.

Doba kultivácie: Hoci je bunková línia HuH7 nesmrteľná, prekročenie doby kultivácie môže postupne ovplyvniť zdravie buniek. Môže to ovplyvniť rýchlosť proliferácie a génovú expresiu, čo môže znížiť reprodukovateľnosť výsledkov. V prípade buniek HuH7 by sa počet pasáží mal udržať pod hranicou 20–25.

Aplikácie buniek HuH-7

Táto bunková línia odvodená z ľudského hepatómu ponúka mnoho výskumných aplikácií. Tu popisujeme niekoľko oblastí výskumu, v ktorých sa používa bunková línia HuH7.

1. Lieková rezistencia: HuH7 je bunková línia hepatocelulárneho karcinómu (HCC), ktorú možno použiť na štúdium liekovej rezistencie voči potenciálnym liečbám rakoviny pečene. V štúdii vykonanej v roku 2021 sa použili bunky HuH7, ktoré boli experimentálne zmenené na rezistentné voči sorafenibu, na vývoj nových a účinných liečiv, t. j. samousporiadajúcich sa peptidov akumulujúcich sa v mitochondriách.

2. Genetické poznatky a molekulárne profilovanie prostredníctvom buniek HuH7: Jedinečné bunkové línie HuH7, vrátane rôznych derivátov a variantov, umožnili hlbšie pochopenie génovej expresie a úlohy špecifických genomických markerov pri ochoreniach. Techniky, ako je Ramanova spektroskopia, ktorú presadzujú výskumníci ako Evgeny Gladilin, sa aplikovali na bunky HuH7 na účely molekulárneho a bunkového profilovania, čím sa získali poznatky o bunkovej odpovedi na vírusovú infekciu. Potenciál Ramanovej spektroskopie v kombinácii s metódami, ako je kvantitatívna proteomika, uľahčil skúmanie reakcií hostiteľských buniek, vrátane interferónovej reakcie a zmien v lipidových kvapôčkach, ktoré sú kľúčové pre pochopenie replikácie HCV a účinku SARS. Expresiu rôznych onkogénnych markerov je možné skúmať s cieľom pochopiť ich správanie v reakcii na akúkoľvek liečbu, ako napríklad v štúdii, ktorá použila bunky HuH7 na skúmanie vplyvu zlúčeniny kaempferolu na expresný vzorec génov MMP9 a AKT. Tieto dráhy regulujú metastázy a invazívnosť hepatocelulárneho karcinómu. Ďalšia nedávna štúdia tiež skúmala úlohu génu signálnej kaskády Wnt/β-katenín v prežití a raste buniek HCC.

3. Vývoj liekov: Bunky HuH7 sa široko používajú v skríningu liekov a štúdiách vývoja liekov proti rakovine pečene. Bolo vykonaných viacero štúdií s cieľom preskúmať inhibičný potenciál mnohých rastlinných extraktov, zlúčenín rastlinného pôvodu, nanočastíc a iných terapeutických látok proti HCC. Štúdia vykonaná v roku 2022 skúmala proapoptotické a protinádorové vlastnosti rádionuklidu proti hepatocelulárnemu karcinómu s použitím buneckej línie HuH7.

4. Bunky HuH7: Stredobod vírusového výskumu a bunkovej analýzy Bunky HuH7 sa stali základným kameňom štúdia vírusových infekcií a infekčných ochorení, najmä vírusu hepatitídy C (HCV) a ich interakcií s koronavírusmi, ako je SARS-CoV-2, zodpovedným za ochorenie COVID-19. Vývoj experimentálnych systémov kultivácie buniek HCV (HCVcc) s využitím buniek HuH7 výrazne posunul naše schopnosti skúmať zložitý proces replikácie HCV a faktory hostiteľa, ktoré sú nevyhnutné pre infekciu HCV. To zahŕňa skúmanie efektívnosti replikácie RNA HCV a produkcie infekčných vírusových častíc. Rôzne línie buniek HuH7, vrátane senescentných a infikovaných variantov, poskytujú rozmanitý panel na skúmanie mnohorakosti infekcie, šírenia vírusov a inhibičných mechanizmov proti vírusom, ako je SARS.

Zhrnuté, štúdium buniek HuH7 zahŕňa široké spektrum vedeckých výskumov, od molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom vírusových infekcií, až po podrobné bunkové reakcie vyvolané týmito patogénmi. Prostredníctvom výskumu buniek HuH7 vedecká komunita naďalej odhaľuje komplexnú dynamiku interakcií medzi hostiteľom a vírusom, čím prispieva k pokroku v antivírusových stratégiách a k nášmu pochopeniu bunkových determinantov vírusových ochorení.

Publikácie o HuH-7

Existuje množstvo publikácií, ktoré využívajú bunkovú líniu HuH7 na rôzne účely. Tu sme spomenuli niekoľko nedávnych a významných publikácií.

• Aplikácia samousporiadajúcich sa peptidov zameraných na mitochondrie ako nová liečba buniek hepatocelulárneho karcinómu rezistentných na sorafenib.

Táto štúdia bola uverejnená v časopise Nature Scientific Reports v roku 2021. V štúdii sa použili experimentálne indukované bunky hepatocelulárneho karcinómu rezistentné na sorafenib (bunky línie HuH7) na skúmanie proapoptotických a protinádorových účinkov nedávno vyvinutých Mito-FF (peptidov s vlastnou štruktúrou, ktoré sa hromadia v mitochondriách).

• Kaempferol inhibuje migráciu buniek ľudského hepatocelulárneho karcinómu potlačením MMP-9 a Akt signálnej dráhy

Tento článok bol uverejnený v časopise Environmental Toxicology autorom Po-Chung Ju a kolegami v roku 2021. V tejto štúdii výskumníci skúmali protimetastatický potenciál rastlinnej zlúčeniny kaempferolu proti bunkám hepatocelulárneho karcinómu (HuH7). Okrem toho študovali aj signálne dráhy regulujúce metastázy a inváziu buniek rakoviny pečene.

• Daphnetín inhibuje prežívanie buniek hepatocelulárneho karcinómu prostredníctvom regulácie signálnej dráhy Wnt/β-katenín

Tento článok bol uverejnený v časopise Drug Development Research v roku 2022. Táto štúdia vysvetľuje protinádorovú úlohu zlúčeniny daphnetínu proti HCC. Táto zlúčenina rastlinného pôvodu inhibuje Wnt/β-katenínovú signalizáciu, čím obmedzuje rast rakovinových buniek.

• RGFP966 potláča rast a migráciu nádoru prostredníctvom inhibície expresie EGFR v bunkách hepatocelulárneho karcinómu in vitro

Tento výskumný článok, uverejnený v časopise Drug Design, Development, and Therapy, opisuje úlohu signálnej dráhy EGFR v raste a metastázovaní hepatocelulárneho karcinómu. V štúdii sa použili bunky HuH7 na skúmanie inhibičného účinku RGFP966, inhibítora histónovej deacetylázy 3 (HDAC3), proti HCC prostredníctvom potlačenia génov dráhy EGFR.

• Perrhenát rénium (188ReO4) indukoval apoptózu a znížil rakovinový fenotyp v bunkách rakoviny pečene

Táto publikácia v časopise Cells poukazuje na použitie buniek HuH7 pri skúmaní potenciálu rádionuklidu, t. j. perrhenátu réna, proti HCC.

• Antivírusová aktivita nanočastíc chitosanu obsahujúcich kurkumín proti vírusu hepatitídy C genotypu 4a v ľudských hepatómových bunkových líniách

Táto štúdia bola uverejnená v časopise International Journal of Nanomedicine. V štúdii sa použili bunky HuH7 na skúmanie antivírusovej aktivity nanočastíc chitosanu obsahujúcich kurkumín proti genotypu 4a vírusu HCV.

Zdroje pre HuH-7: protokoly, videá a ďalšie

K dispozícii je mnoho zdrojov týkajúcich sa kultivácie a udržiavania buniek línie HuH7. Tu sa dozviete o zdrojoch, ktoré vysvetľujú protokoly kultivácie buniek a transfekcie pre HuH7, a o vzdelávacích videách.

Protokoly kultivácie buniek

Nasledujúce zdroje vám pomôžu začať s kultiváciou a udržiavaním buniek HuH7.

• Informácie a zdroje o kultivácii buniek HuH-7: Táto webová stránka obsahuje množstvo užitočných informácií, vrátane protokolu subkultivácie buniek HuH7, ich skladovania a manipulácie s nimi.

• Protokol kultivácie buniek HuH7

Protokoly transfekcie buniek HuH7

Bunky HuH7 sa transfekujú mnohými spôsobmi. Nasledujúce zdroje poskytujú množstvo informácií týkajúcich sa protokolov transfekcie, potrebných reagentov a chemikálií, užitočných tipov a bezpečnostných opatrení.

Videá týkajúce sa buniek HuH7

K dispozícii je mnoho vzdelávacích videí o základných protokoloch subkultivácie, nanášania na platne a transfekcie a ďalších témach.

• Pasážovanie buniek: Základy kultivácie buniek: Toto video sa venuje základnému protokolu kultivácie tejto buneckej línie.

Veríme, že informácie uvedené v tomto článku vám pomôžu získať základné aj pokročilé znalosti o bunkovej línii HuH7 ešte predtým, ako s ňou začnete pracovať. Ak chcete tieto bunky použiť vo svojom výskume, môžete si ich u nás objednať.

Často kladené otázky týkajúce sa buneckej línie HuH7 a výskumu vírusov