Bunky HuH7: Brána k výskumu hepatómov a HCV

Bunková línia HuH7 odvodená z ľudského hepatómu predstavuje imortalizovanú kolekciu nádorových epitelových buniek. Táto línia spolu s jej derivátmi HuH7.5 a HuH7.5.1 slúži ako praktická náhrada primárnych hepatocytov v experimentálnych podmienkach. Prevažne sa využíva v modeloch bunkových kultúr na skúmanie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) a patofyziológie hepatómov.

Pôvod a charakteristika buniek HuH7

Pred použitím bunkovej línie HuH7 vo výskume je nevyhnutné pochopiť jej pôvod, kľúčové vlastnosti a optimálne podmienky kultivácie.

Bunkovú líniu HuH7 vytvorili Sato, J a Nakabayshi, H v roku 1982, pričom bola odvodená z vysoko diferencovanej línie rakovinových hepatocytov. Pôvodne pochádzala z hepatocelulárneho karcinómu 57-ročného japonského muža. Bunky HuH7, ktoré sa vyznačujú schopnosťou produkovať rôzne fyziologicky relevantné látky, ako je albumín a alfa-fetoproteín, vykazujú vysokú citlivosť na infekciu HCV, vďaka čomu sú vhodné na použitie v replikónových systémoch HCV. Táto vlastnosť robí túto bunkovú líniu cennou pre skríning a vývoj anti-HCV terapeutík. Bunky HuH7 vykazujú morfológiu podobnú epitelu, majú šesťuholníkový tvar a počas rastu priľnú k povrchu a vytvárajú 2D monovrstvy. bunky HuH7 majú v priemere priemer 21,9 µm, pričom majú tendenciu k väčšiemu, sploštenému vzhľadu . Bunková línia HuH7 sa vyznačuje heterogénnym počtom chromozómov, ktorý sa zvyčajne pohybuje medzi 55 a 63, čo odráža genetickú variabilitu v rámci bunkovej populácie. Táto heterogenita je dôsledkom selektívnych tlakov, ktoré sa vyskytujú počas kultivácie buniek, a môže sa líšiť v rôznych laboratórnych podmienkach.

Porovnávacia analýza: bunkové línie HuH7 vs. HuH7.5

Bunková línia HuH7.5, derivát HuH7, sa líši predovšetkým missense mutáciou v géne RIG-I (DDX58), ktorý je kľúčový pre vnútrobunkovú protivírusovú odpoveď. Táto mutácia zvyšuje permisivitu buniek HuH7.5 pre replikáciu genómovej a subgenómovej HCV RNA, čím sa líši od materskej bunkovej línie HuH7 z hľadiska jej využiteľnosti vo virologickom výskume.

Kultivácia buniek HuH7: Základné protokoly pre optimálny rast

Bunky HuH7, ktoré sú neoddeliteľnou súčasťou nespočetného množstva výskumných štúdií, si vyžadujú presné kultivačné podmienky, aby sa im darilo. Táto časť sa zaoberá základnými aspektmi kultivácie buniek HuH7, ktoré zabezpečujú zachovanie ich fyziologického významu vo vedeckých výskumoch.

Dynamika času zdvojenia

Čas zdvojenia buniek HuH7 je zvyčajne 24 hodín, hoci rozdiely v kultivačných médiách môžu toto obdobie predĺžiť na 36-48 hodín, čo poukazuje na vplyv podmienok prostredia na bunkovú proliferáciu.

Charakteristiky adhézie

Bunky HuH7 tvoria prevažne dvojrozmernú monovrstvu, ktorá prilieha k povrchu kultivačných platní a fliaš, čo poukazuje na ich preferenciu stabilného fyzického substrátu pred suspenznými kultúrami.

Optimálna hustota výsevu

Udržiavanie konfluencie buniek HuH7 v rozmedzí 30 - 90 % je rozhodujúce, aby sa zabránilo poklesu miery proliferácie nad 90 % konfluencie. Subkultivácia s akutázou uľahčuje oddeľovanie, čo umožňuje výsev s hustotou prispôsobenou experimentálnym potrebám, od optimálnej (2×10⁴ buniek/cm²) až po nasycujúcu (6×10⁴ buniek/cm²) úroveň.

Výživové požiadavky

Dulbeccovo modifikované orlie médium (DMEM) s vysokým obsahom glukózy a doplnené 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS) poskytuje ideálne nutričné prostredie pre bunky HuH7. Pravidelná obnova média, ideálne 2 - 3-krát týždenne, je rozhodujúca pre trvalé zdravie buniek.

Podmienky prostredia

Inkubátor so zvlhčovaním vzduchu nastavený na 5 % CO₂ a 37 °C optimálne podporuje kultiváciu buniek HuH7 a simuluje fyziologické podmienky vhodné pre bunkové aktivity.

Dlhodobé skladovanie

Na dlhšie uchovávanie by sa bunky HuH7 mali skladovať v parnej fáze tekutého dusíka, čím sa zabezpečí ich životaschopnosť pre budúci výskum.

Kryokonzervácia a regenerácia

Na zachovanie životaschopnosti buniek počas kryokonzervácie je najdôležitejšie použiť techniku postupného zmrazovania. Bunky by sa mali suspendovať v špeciálne navrhnutom zmrazovacom médiu, ako je CM-1, čím sa zabezpečí hladký prechod na kryogénne skladovanie. Po rozmrazení je na obnovenie bunkových kultúr nevyhnutné rýchle, ale šetrné oživenie vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C, po ktorom nasleduje odstredenie na odstránenie zmrazovacieho média a opätovná suspenzia v čerstvom rastovom médiu.

Úvahy o biologickej bezpečnosti

Pri manipulácii s bunkovou líniou HuH7 a jej množení sa odporúča dodržiavať protokol úrovne biologickej bezpečnosti 1, ktorý je v súlade s bezpečnostnými a etickými normami v laboratórnych podmienkach.

Dodržiavaním týchto presne stanovených podmienok kultivácie môžu výskumníci zabezpečiť robustný rast a fyziologickú relevantnosť buniek HuH7 pri svojich vedeckých výskumoch, čím sa pripraví pôda pre prevratné objavy v oblasti výskumu hepatómu a vírusu hepatitídy C.

Preskúmajte bunky HuH7 pre svoje vedecké objavy

Bunky HuH7: Výhody a nevýhody

Bunková línia HuH7 ponúka výhody aj obmedzenia zároveň. Prejdime si potenciálne výhody a nevýhody tejto bunkovej línie, pretože vám to môže pomôcť rozhodnúť sa, či je vhodná pre vaše experimenty.

Výhody bunkovej línie HuH7

Bunky HuH7 majú mnoho charakteristických vlastností, ktoré ich robia atraktívnymi na výskumné použitie.

• Jednoduché rozmnožovanie: CLS však odporúča používať RPMI 1640 s 10 % FBS a 2 mM L-glutamínom. Bunky HuH-7 vylučujú rastový faktor, ktorý pomáha bunkám rásť bez séra.
• Flexibilita transfekcie: Bunková líniaHuH7 sa široko používa na účely transfekcie vďaka svojej vysokej vnímavosti voči genómu HCV. Preto sú tieto bunky kľúčové pre skríning a vývoj liekov proti HCV.
• Alternatíva ľudských hepatocytov: Bunková línia HuH7 je vynikajúcou náhradou ľudských hepatocytov. Môže pomôcť výskumníkom pri štúdiu pečeňových transportérov liečiv a pochopiť interakciu určitých liečiv s MRP (proteínmi spojenými s viacnásobnou liekovou rezistenciou).
• Vývoj xenotransplantačného myšieho modelu: Bunky HuH7 sa použili na vytvorenie xenotransplantačného modelu myši vytvoreného z bunkovej línie. Tento zvierací model môže výskumníkom poskytnúť cenné poznatky o inhibítoroch proteínkináz a protinádorových terapiách.
• Výskum rakoviny: Bunková línia HuH7 je ľudská bunková línia rakoviny pečene, ktorá pomáha výskumníkom vykonávať štúdie rakoviny pečene.

Obmedzenia bunkovej línie HuH-7

S kultiváciou bunkovej línie HuH7 sú spojené určité obmedzenia.

Mikrobiálna kontaminácia: Bakteriálna kontaminácia je najčastejším problémom pri kultivácii buniek. Ak dôjde k infekcii, možno ju rozoznať na základe zmeny pH a zakalenia kultivačného média. Medzi bakteriálnou kontamináciou sa zvyčajne neprejavuje kontaminácia mykoplazmou. Pomaly však ovplyvňuje morfológiu, expresiu génov a ďalšie vlastnosti bunkovej línie.

Doba kultivácie: Hoci je bunková línia HuH7 nesmrteľná, prekročenie obdobia kultivácie môže postupne ovplyvniť zdravie buniek. Môže ovplyvniť rýchlosť proliferácie a expresiu génov, čo môže znížiť reprodukovateľnosť výsledkov. V prípade bunkovej línie HuH7 by sa počet pasáží mal udržiavať pod 20 - 25.

Použitie buniek HuH-7

Táto bunková línia odvodená od ľudského hepatómu ponúka mnoho výskumných aplikácií. Tu opisujeme niekoľko oblastí výskumu využívajúcich bunkovú líniu HuH7.

1. Rezistencia na lieky: HuH7 je bunková línia hepatocelulárneho karcinómu (HCC), ktorá sa môže použiť na štúdium rezistencie na lieky proti potenciálnej liečbe rakoviny pečene. V štúdii uskutočnenej v roku 2021 sa použili bunky HuH7, ktoré sa experimentálne stali rezistentnými voči sorafenibu, na vývoj nových a účinných terapeutík, t. j. mitochondrií akumulujúcich samoskladné peptidy.

2. Genetické poznatky a molekulárne profilovanie prostredníctvom buniek HuH7: Odlišné bunkové línie HuH7 vrátane rôznych derivátov a variantov umožnili hlbšie pochopenie expresie génov a úlohy špecifických genomických markerov pri ochorení. Techniky ako Ramanova spektroskopia, ktorú presadzovali výskumníci ako Evgeny Gladilin, sa použili na bunky HuH7 na molekulárne a bunkové profilovanie, čím sa odhalil pohľad na bunkovú odpoveď na vírusovú infekciu. Potenciál Ramanovej spektroskopie v kombinácii s metódami, ako je kvantitatívna proteomika, uľahčil skúmanie reakcií hostiteľských buniek vrátane interferónovej odpovede a zmien v lipidových kvapôčkach, ktoré sú rozhodujúce pre pochopenie replikácie HCV a účinku SARS. Expresiu rôznych onkogénnych markerov možno skúmať s cieľom pochopiť ich správanie v reakcii na akúkoľvek liečbu, ako napríklad v štúdii, ktorá použila bunky HuH7 na skúmanie účinku zlúčeniny kaempferolu na vzor expresie génov dráhy MMP9 a AKT. Tieto dráhy regulujú metastázovanie a invazivitu hepatocelulárneho karcinómu. V ďalšej nedávnej štúdii sa skúmala aj úloha génov signálnej kaskády Wnt/β-katenín pri prežívaní a raste buniek HCC.

3. Vývoj liekov: Bunky HuH7 sa široko používajú pri skríningu a vývoji liekov proti rakovine pečene. Vykonalo sa viacero štúdií na preskúmanie inhibičného potenciálu mnohých rastlinných extraktov, zlúčenín na báze rastlín, nanočastíc a iných terapeutických látok proti HCC. V štúdii uskutočnenej v roku 2022 sa skúmali proapoptotické a protirakovinové vlastnosti rádionuklidu proti hepatocelulárnemu karcinómu s použitím bunkovej línie HuH7.

4. Bunky HuH7: Bunky HuH7 sa stali základnýmkameňom pri štúdiu vírusových infekcií a infekčných ochorení, najmä vírusu hepatitídy C (HCV) a ich interakcií s koronavírusmi, ako je SARS-CoV-2, ktorý je zodpovedný za koronavírusové ochorenie 2019 (COVID-19). Vývoj experimentálnych systémov bunkových kultúr HCV (HCVcc) s použitím buniek HuH7 výrazne posunul našu schopnosť študovať zložitý proces replikácie HCV a hostiteľské faktory nevyhnutné pre infekciu HCV. To zahŕňa skúmanie účinnosti replikácie HCV RNA a produkcie infekčných viriónov. Odlišné línie buniek HuH7 vrátane senescentných a infikovaných variantov poskytujú rôznorodý panel na skúmanie multiplicity infekcie, šírenia vírusu a mechanizmov inhibície proti vírusom, ako je SARS.

Celkovo možno povedať, že štúdium buniek HuH7 zahŕňa široké spektrum vedeckých výskumov, od molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom vírusových infekcií, až po podrobné bunkové reakcie vyvolané týmito patogénmi. Prostredníctvom výskumu HuH7 vedecká komunita naďalej odhaľuje komplexnú dynamiku interakcií medzi hostiteľom a vírusom, čím prispieva k rozvoju antivírusových stratégií a k nášmu pochopeniu bunkových determinantov pri vírusových ochoreniach.

Publikácie o HuH-7

Existuje množstvo publikácií využívajúcich bunkovú líniu HuH7 na rôzne účely. Tu sme uviedli niekoľko nedávnych a významných publikácií.

• Aplikácia samorozkladných peptidov zameraných na mitochondrie ako nová liečba buniek hepatocelulárneho karcinómu rezistentných na sorafenib.

Táto štúdia bola uverejnená v časopise Nature Scientific Reports v roku 2021. V štúdii sa použili experimentálne vyvolané bunky hepatocelulárneho karcinómu rezistentné na sorafenib (bunková línia HuH7) na skúmanie proapoptotických a protinádorových účinkov nedávno vyvinutých peptidov Mito-FF (mitochondrie akumulujúce peptidy na samoskladanie).

• Kaempferol inhibuje migráciu buniek ľudského hepatocelulárneho karcinómu potlačením signalizácie MMP-9 a Akt

Tento článok publikovali Po-Chung Ju a jeho kolegovia v časopise Environmental Toxicology v roku 2021. V tejto štúdii vedci skúmali antimetastatický potenciál zlúčeniny rastlinného pôvodu, kaempferolu, proti bunkám hepatocelulárneho karcinómu (HuH7). Okrem toho skúmali aj signálne dráhy regulujúce metastázovanie a inváziu buniek rakoviny pečene.

• Dafnetín inhibuje prežívanie buniek hepatocelulárneho karcinómu prostredníctvom regulácie Wnt/β-katenínovej signálnej dráhy

Tento článok bol uverejnený v časopise Drug Development Research v roku 2022. Táto štúdia vysvetľuje protirakovinovú úlohu zlúčeniny dafnetínu proti HCC. Táto zlúčenina rastlinného pôvodu inhibuje signalizáciu Wnt/β-katenínu, čím obmedzuje rast rakovinových buniek.

• RGFP966 potláča rast a migráciu nádorov prostredníctvom inhibície expresie EGFR v bunkách hepatocelulárneho karcinómu in vitro

Táto výskumná práca uverejnená v časopise Drug Design, Development, and Therapy opisuje úlohu signalizácie EGFR pri raste a metastázovaní hepatocelulárneho karcinómu. V štúdii boli použité bunky HuH7 na skúmanie inhibičného účinku RGFP966, inhibítora históndeacetylázy 3 (HDAC3), proti HCC prostredníctvom potlačenia génov dráhy EGFR.

• Perrhenát rénia (188ReO4) vyvolal apoptózu a znížil rakovinový fenotyp v bunkách rakoviny pečene

Táto publikácia v časopise Cells poukazuje na použitie buniek HuH7 pri skúmaní anti-HCC potenciálu rádionuklidu, t. j. perrhenátu rénia.

• Antivírusová aktivita chitosanových nanočastíc zapuzdrených do kurkumínu proti vírusu hepatitídy C genotypu 4a v ľudských hepatómových bunkových líniách

Táto štúdia bola uverejnená v časopise International Journal of Nanomedicine. V štúdii sa použili bunky HuH7 na skúmanie antivírusovej aktivity chitosanových nanočastíc obsahujúcich kurkumín proti HCV genotypu 4a.

Zdroje HuH-7: Protokoly, videá a ďalšie zdroje

K dispozícii je mnoho zdrojov na kultiváciu a udržiavanie bunkovej línie HuH7. Tu sa dozviete o dostupných zdrojoch na vysvetlenie protokolov kultivácie a transfekcie buniek pre HuH7 a o vzdelávacích videách.

Protokoly kultivácie buniek

Nasledujúce zdroje vám môžu pomôcť začať s kultiváciou a údržbou HuH7.

• Informácie a zdroje o bunkovej kultúre HuH-7: Táto webová stránka obsahuje množstvo užitočných informácií vrátane protokolu subkultivácie bunkovej línie HuH7, jej skladovania a manipulácie s ňou.

• Protokol kultivácie buniek HuH7

Protokoly transfekcie HuH7

Bunky HuH7 sa transfekujú mnohými spôsobmi. Nasledujúce zdroje poskytujú množstvo informácií týkajúcich sa transfekčných protokolov, potrebných činidiel a chemikálií, užitočných tipov a bezpečnostných opatrení.

Videá týkajúce sa bunkovej línie HuH7

K dispozícii je mnoho vzdelávacích videí o základnej subkultivácii, plátovaní a transfekčných protokoloch a ďalších.

• Pasážovanie buniek: Toto video je ozákladnom protokole kultivácie bunkovej línie.

Očakávame, že informácie uvedené v tomto článku vám pomôžu získať základné a pokročilé znalosti o bunkovej línii HuH7 pred prácou s ňou. Ak chcete tieto bunky použiť vo svojej výskumnej práci, môžete si ich u nás objednať.

Často kladené otázky týkajúce sa bunkovej línie HuH7 a výskumu vírusov