Bunky HEK293T: Využitie potenciálu v štúdiách transfekcie

Bunky HEK293T sú ľudské embryonálne obličkové bunky široko používané v priemyselnej biotechnológii, toxikológii a výskume rakoviny. Tieto imortalizované bunky sa tiež používajú na produkciu rôznych terapeutických proteínov a vírusov.

Všeobecné charakteristiky a pôvod buniek HEK293T

Táto časť článku sa venuje pôvodu a všeobecným informáciám o bunkovej línii HEK293T. 

• Bunka HEK293T pochádza z primárnych ľudských embryonálnych obličkových buniek kultivovaných v laboratóriu. Výskumníci vyvinuli tieto bunky na začiatku 70. rokov 20. storočia transfekciou embryonálnych obličkových buniek fragmentmi DNA adenovírusu typu 5. Výskumníci vytvorili bunkovú líniu HEK293T zavedením veľkého T-antigénu opičieho vírusu 40 (SV40) do genómu buniek HEK293. Táto modifikácia umožnila výskumníkom ľahko transfekovať bunky 293 a urobila ich vhodnými na produkciu proteínov a štúdie génovej expresie [1].
• Bunky HEK293T majú morfológiu podobnú epitelu. Majú podlhovastý a sploštený tvar s jasne ohraničenými bunkovými hranicami.
• Veľkosť buniek HEK293T sa pohybuje v rozmedzí 11 až 15 µm v priemere.
• Bunky HEK293T s veľkým T-antigénom SV40 majú komplexný karyotyp. Tieto bunky sú hypotriploidné, obsahujú trikrát menej chromozómov ako haploidná gaméta a majú modálny počet chromozómov 64.

Aký je rozdiel medzi HEK293T a HEK293?

Obidve bunky HEK293 a HEK293T sú ľudského pôvodu. HEK293T je populárny derivát buniek HEK293. Vedci vyvinuli tieto bunky z pôvodných ľudských embryonálnych obličkových buniek 293 ich transfekciou veľkým T antigénom SV40, zatiaľ čo imortalizované bunky HEK293 vytvorili transformáciou a kultiváciou ľudských embryonálnych obličkových buniek s fragmentmi DNA ľudského adenovírusu 5.

Bunkové technológie a biomedicínske využitie buniek HEK293T

Bunka kultúra a bankovanie v HEK293T výskume

Bunky HEK293T, ktoré pochádzajú z ľudských embryonálnych obličkových buniek 293, nachádzajú široké uplatnenie v bunkovej kultúre vďaka svojmu robustnému rastu a ľahkej transfekcii. Na prácu s týmito bunkami musia výskumníci uprednostniť bankovanie buniek, čo zahŕňa skladovanie buniek na účely dlhodobého výskumu a terapeutického využitia. Musia používať postupné bankovanie buniek, aby zachovali vlastnosti buniek a zabezpečili ich dlhodobú životaschopnosť. Vytváranie bunkových bánk si vyžaduje dodržiavanie predpisov o správnej výrobnej praxi, aby sa zabezpečila životaschopnosť a integrita buniek pre terapeutické aplikácie.

Správna výrobná prax je kľúčová pri výrobe bunkových bánk HEK293T, ktoré sú základom pre výskumné aj terapeutické aplikácie. Hlavná bunková banka slúži ako referenčný bod pre všetky následné bunkové produkty. Výroba týchto buniek pre terapeutické aplikácie, ako je napríklad produkcia lentivírusov pre génové terapie, sa riadi prísnymi regulačnými normami, aby bola zabezpečená bezpečnosť a účinnosť konečných produktov.

Protokoly a testy s použitím HEK293T

V cytotechnológii sú navrhnuté špecifické protokoly a testy na hodnotenie vlastností buniek HEK293T. Patria sem hodnotenie účinnosti vektorov génovej terapie a interakcie buniek s extracelulárnou matricou v kultivačnej miske alebo suspenznej kultúre. Aby sa zachovala integrita buniek HEK293T, výskumníci s presnosťou vyberajú reagencie na transfekciu a suroviny podrobujú prísnym testom kontroly kvality.

Výskumné aplikácie buneckej línie HEK293T

• Vývoj vakcín: Bunky HEK293T sa používajú na štúdium vírusov a výrobu vakcín na báze vírusových vektorov na boj proti rôznym vírusovým infekciám. V jednej štúdii sa táto embryonálna obličková bunková línia použila na skúmanie štrukturálnych a funkčných základov vstupu vírusu COVID-19 do buniek prostredníctvom ľudského enzýmu konvertujúceho angiotenzín 2 (ACE2) [3]. Okrem toho sa v nedávnej štúdii použili bunky HEK93T na vytvorenie lentivírusových častíc pseudotypizovaných špicou SARS-CoV-2 [4].
  
• Toxikologický výskum: Táto ľudská embryonálna obličková bunková línia sa široko používa na testovanie toxicity a účinnosti liekov. Výskum vykonaný v roku 2022 použil HEK293T ako normálnu ľudskú bunkovú líniu na overenie cytotoxického potenciálu extraktov Caladium lindenii proti bunkovej línii rakoviny pečene HepG2 [5].
• Štúdie génovej expresie: Bunky HEK293T s veľkým T-antigénom SV40 sú veľmi vhodné na transfekciu, a teda aj na štúdie génovej expresie. V jednej štúdii sa bunky HEK293T použili na skúmanie úlohy dlhej nekódujúcej RNA SNHG16 pri regulácii funkcií trofoblastov. Štúdia odhalila, že LncRNA SNHG16 interaguje s osou miR-218-5p/LASP1 a sprostredkúva tieto účinky [6].

Inovácie v bunkovej terapii s využitím buniek HEK293T

Pokroky v bunkovej terapii s HEK293T

Bunky HEK293T významne prispievajú k rozvoju buneckej terapie, najmä pri tvorbe vírusových vektorov pre génovú terapiu. Tieto bunky sú nevyhnutné vo výrobných procesoch, ktoré dodržiavajú predpisy správnej výrobnej praxe, pretože zabezpečujú výrobu vysoko kvalitných produktov génovej terapie. Školenie výrobného personálu sa tiež zameriava na narábanie s jedinečnými vlastnosťami buniek HEK293T a udržiavanie vysokého štandardu liekov odvodených z týchto buniek.

Bunky HEK293T v klinických štúdiách a génovej terapii

Bunka HEK293T hrá kľúčovú úlohu vo vývoji produktov génovej terapie a je neoddeliteľnou súčasťou klinických štúdií zameraných na uvedenie nových bunkových terapií na trh. To zahŕňa využitie vysokej transfektivity buniek na dodávanie génov s využitím vektorov, ako sú lentivírusové baliace vektory, kde mutácia integrázy D64V predstavuje významný pokrok v zvyšovaní bezpečnosti.

Inovatívne techniky v kultivácii buniek HEK293T

Všestrannosť buniek HEK293T podporuje inovatívne techniky v dvojrozmerných aj zložitejších rozmerových bunkových kultúrach. Táto prispôsobivosť je kľúčová pri skúmaní bunkových produktov pre rôzne typy biomedicínskeho výskumu, vrátane výskumu rakoviny, kde sa tieto bunky používajú na štúdium tumorigenických procesov a testovanie liekov. Okrem toho je línia HEK293T dôležitá pri výrobe lentivírusových častíc, ktoré sú kľúčové pre výskumné aj terapeutické procesy výroby vektorov.

Kúpte si bunky HEK293 pre svoj výskum

Posuňte svoj výskum na vyššiu úroveň s našimi bunkami HEK293, ktoré sú známe svojou prispôsobivosťou v štúdiách génovej expresie a výrobe vakcín. Naša ponuka zahŕňa univerzálne deriváty, ako sú HEK293T, línie HEK293 prispôsobené na kultiváciu v suspenzii, HEK293T/17, AAV-293 a 2V6.11. Objavte náš široký výber produktov, ktoré podporia a posunú vašu experimentálnu prácu vpred.

Informácie o kultivácii buniek línie HEK293T

Bunky HEK293T sa vo veľkom množstve kultivujú vo výskumných laboratóriách. Pred začatím kultivácie buniek HEK293T je potrebné vedieť: Aká je doba zdvojnásobenia buniek HEK293T? Čo je kultivačné médium HEK293T? Aká je hustota výsevu buniek HEK293T?

Kľúčové body pre kultiváciu buniek HEK293T

Doba zdvojnásobenia:

Doba zdvojnásobenia uvádzaná pre bunky HEK293T je 30 hodín.

Adherentné alebo v suspenzii:

HEK293T je adhezívna bunková línia.

Hustota výsevu:

Bunky HEK293T sa vysievajú v hustote 1 x 10⁴ buniek/cm². Pri tejto hustote výsevu môžu bunky vytvoriť konfluentnú monovrstvu približne za 4 dni. Na výsev sa adhezívne bunky oddelia pomocou disociačného roztoku Accutase. Uvoľnené bunky sa odstreďujú a potom sa opatrne resuspendujú pomocou rastového média. Následne sa bunky rozdelia do nových fliaš na kultiváciu.

Rastové médium:

Bunky HEK293T sa kultivujú v EMEM (Eagle's minimal essential medium) obsahujúcom 1,0 g/l L-glukózy, 2,2 g/l NaHCO3, 2,0 mM L-glutamínu a 10 % fetálneho bovinného séra. Médium by sa malo vymieňať dvakrát týždenne.

Podmienky rastu:

Kultúry buniek HEK293T sa uchovávajú v zvlhčenom inkubátore pri teplote 37 °C s prívodom 5 % CO2.

Skladovanie:

Ľudské embryonálne obličkové bunky HEK293T sa skladujú vo fáze pary tekutého dusíka alebo pri teplote nižšej ako -150 °C po dlhšiu dobu.

Proces zmrazovania a médium:

Bunky HEK293 možno zmraziť v zmrazovacích médiách CM-1 alebo CM-ACF. Pre bunky HEK293T sa odporúčajú pomalé procesy zmrazovania, ktoré umožňujú postupný pokles teploty o 1 °C, aby sa zachovala ich životaschopnosť.

Proces rozmrazovania:

Fľaštičku so zmrazenými bunkami rýchlo premiešavame vo vodnom kúpeli (37 °C), kým nezostane len malá hrudka ľadu. Bunky resuspendujeme v médiu a odstreďujeme, aby sme odstránili zložky mraziaceho média. Získané bunky sa potom kultivujú v nových fľašiach obsahujúcich rastové médium. 

Úroveň biologickej bezpečnosti:

Na manipuláciu a udržiavanie kultúr buniek HEK293T je potrebné laboratórium s úrovňou biologickej bezpečnosti 1.

Často kladené otázky o kultúre a aplikáciách buniek HEK293T

Bunky HEK293T: Vedecké publikácie

V tejto časti sme spomenuli niekoľko sľubných výskumných publikácií, ktoré sa zaoberajú bunkami HEK293T.

Vývoj mRNA vakcín proti SARS-CoV-2 kódujúcich N-terminálny a receptorovo viažuci domény proteínu Spike

Táto publikácia vyjde v BioRxiv v roku 2022. V tejto štúdii sa použili bunky HEK293T na vývoj mRNA vakcín proti vírusu COVID-19 kódujúcich N-terminálny gén spike a domény RBD (domény viažuce sa na receptor).

Kruhová HER2 RNA pozitívna trojnásobne negatívna rakovina prsníka je citlivá na pertuzumab

Tento výskum bol uverejnený v časopise Molecular Cancer v roku 2020. Štúdia navrhla, že expresia cirkulárnej HER2 RNA v trojnásobne negatívnych rakovinových bunkách prsníka spôsobuje ich citlivosť na liečbu liekom Pertuzumab. V tejto štúdii výskumníci použili bunky HEK293 na produkciu lentivírusu a transfekciu cirkulárneho génu HER2.

Antivírusová úloha IFITM3 pri infekcii prototypovým penovým vírusom

Tento článok bol uverejnený v časopise Virology Journal v roku 2022. V tejto štúdii sa použili bunky HEK293T na skúmanie antivírusového účinku IFITM3 (interferónom indukovaný transmembránový proteín 3) pri infekcii prototypovým penovým vírusom (PFV).

MiRNA-21 sprostredkováva antiangiogénnu aktivitu metformínu prostredníctvom cielenia na expresiu PTEN a SMAD7 a signálnu dráhu PI3K/AKT

Tento výskumný článok v časopise Nature Scientific Reports (2017) použil bunky HEK293T a skúmal, že miRNA-21 sprostredkováva metformínom indukované antiangiogénne účinky reguláciou signálnej dráhy PI3K/AKT a expresie génov SMAD7 a PTEN.

MicroRNA-608 inhibuje proliferáciu rakoviny močového mechúra prostredníctvom signálnej dráhy AKT/FOXO3a

Tento výskum bol uverejnený v časopise Molecular Cancer v roku 2017. V tejto štúdii sa použili bunky HEK293 na skúmanie antiproliferatívneho potenciálu miRNA-608 proti rakovine močového mechúra.

Zdroje pre bunkovú líniu HEK293T: protokoly, videá a ďalšie

Nižšie uvádzame niekoľko zdrojov týkajúcich sa buniek HEK293T:

• Transfekcia buniek HEK293T.
• Transfekcia buniek HEK: Toto video ukazuje všeobecný protokol transfekcie pre ľudskú embryonálnu obličkovú bunkovú líniu HEK293.
• Pasážovanie buniek: Toto video vysvetľuje postup rozdelenia alebo subkultivácie adhezívnych buniek.

Protokoly kultivácie buniek

Protokoly kultivácie buniek pre bunky HEK293T sú uvedené tu.

• Rozdeľovanie buniek HEK293T: Táto stránka poskytuje podrobný návod krok za krokom na subkultiváciu buniek HEK293.
• Kultivácia ľudských embryonálnych obličkových buniek: Tento odkaz vám poskytne protokol kultivácie buniek HEK293T.

Referencie

1. Tan, E., et al., HEK293 Cell Line as a Platform to Produce Recombinant Proteins and Viral Vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9.
2. Kim, M.J., et al., AMPKα1 reguluje progresiu rakoviny pľúc a prsníka reguláciou signálnej osi TRAF6-BECN1 sprostredkovanej TLR4. Cancers (Basel), 2020, 12(11).
3. Wang, Q., et al., Štrukturálny a funkčný základ vstupu SARS-CoV-2 prostredníctvom ľudského ACE2. Cell, 2020. 181(4): s. 894–904.
4. Gale, E.C., et al., Pomaly sa uvoľňujúca vakcína na báze hydrogélu s podjednotkou domény viažucej sa na receptor vyvoláva neutralizačné protilátkové reakcie proti SARS-CoV-2. bioRxiv, 2021.
5. Kalsoom, A., et al., In vitro hodnotenie cytotoxického potenciálu extraktov z Caladium lindenii na ľudské hepatokarcinómové bunky HepG2 a normálne bunky HEK293T. Biomed Res Int, 2022, s. 1279961.
6. Yu, Z., et al., LncRNA SNHG16 reguluje funkcie trofoblastov prostredníctvom osi miR-218-5p/LASP1. J Mol Histol, 2021. 52(5): s. 1021-1033.