Cultura celulelor mamifere: Fundamente și tehnici
Cultura de celule de mamifere este o tehnică de bază în cercetarea biologică, permițând oamenilor de știință să studieze celulele într-un mediu controlat în afara organismelor vii. Acest proces implică izolarea celulelor din țesuturi, menținerea lor în condiții atent controlate și propagarea lor în diverse scopuri experimentale. Cultura de celule de mamifere este esențială pentru înțelegerea proceselor celulare, a mecanismelor bolilor și pentru dezvoltarea de noi terapii, inclusiv cele care utilizează linii de celule nemuritoare
Idei cheie:
- Celulele pot fi izolate din țesuturi folosind metode de digestie enzimatică sau de cultură a explantelor
- Celulele primare au o durată de viață limitată, în timp ce liniile celulare imortalizate pot prolifera pe termen nedefinit
- Condițiile de cultură, inclusiv compoziția mediului de creștere, sunt esențiale pentru supraviețuirea și proliferarea celulelor
- Celulele pot fi cultivate în suspensie sau ca culturi aderente, în funcție de tipul lor și de nevoile de cercetare
- Medii de cultură comune includ MEM, DMEM și RPMI 1640, fiecare fiind adaptat pentru tipuri specifice de celule
- Condițiile tipice de creștere implică o temperatură de 37°C, 5% CO2 și 95% umiditate relativă
- Alternativele la ser, cum ar fi lizatul plachetar uman (hPL), sunt din ce în ce mai utilizate pentru a evita potențialele probleme de contaminare
Tehnici de izolare celulară
Procesul de creare a unei culturi celulare începe cu izolarea celulelor din țesuturi. Există mai multe metode de a realiza acest lucru, fiecare fiind potrivită pentru diferite tipuri de țesuturi și obiective de cercetare. Pentru probele de sânge, izolarea celulelor este relativ simplă, celulele albe din sânge fiind principalul obiectiv al culturii datorită capacităților lor de creștere. Țesuturile solide necesită tehnici de izolare mai complexe. O metodă comună implică digestia enzimatică, în care enzime precum colagenaza, tripsina sau pronazele sunt utilizate pentru a descompune matricea extracelulară, eliberând celulele individuale în suspensie. Ca alternativă, cercetătorii pot utiliza metoda culturii de explante, în care bucăți mici de țesut sunt plasate direct în medii de creștere, permițând celulelor să migreze și să prolifereze. Alegerea între aceste metode depinde adesea de tipul specific de țesut, de populația celulară dorită și de utilizarea experimentală preconizată. Este important de reținut că celulele izolate direct dintr-un organism sunt denumite celule primare și, cu unele excepții, cum ar fi celulele derivate din tumori, au de obicei o durată de viață limitată în cultură înainte de a intra în senescență
Produse esențiale pentru cultura celulelor de mamifere
| Denumirea produsului | Numărul produsului | Categoria produsului | Aplicație |
|---|---|---|---|
| DMEM, cu: 4,5 g/L Glucoză, cu: 4 mM L-Glutamină, cu: 1,5 g/L NaHCO3, cu: 1,0 mM Piruvat de sodiu | 820300a | Mediu de cultură | Mediu de uz general pentru diferite tipuri de celule de mamifere |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3.1 g/L Glucoză, w: 1.6 mM L-Glutamină, w: 15 mM HEPES, w: 1.0 mM Piruvat de sodiu, w: 1.2 g/L NaHCO3 | 820400a | Mediu de cultură | Potrivit pentru o gamă largă de celule de mamifere, în special celule epiteliale |
| RPMI 1640, cu: 2,1 mM glutamină stabilă, cu: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Mediu de cultură | Utilizate în mod obișnuit pentru celule limfoide și linii celulare hibride |
| Accutase | 830100 | Disociere celulară | Soluție delicată de detașare celulară pentru celule aderente |
| Mediu de congelare CM-1 | 800150 | Crioprezervare | Pentru congelarea și depozitarea pe termen lung a celulelor de mamifere |
| Mediu de congelare CM-ACF, fără ser | 800650 | Crioprezervare | Mediu fără componente animale pentru congelarea celulelor |
| PBS | 860015 | Soluție tampon | Pentru spălarea celulelor și menținerea echilibrului pH-ului |
| Mediu de creștere a celulelor endoteliale | 820731 | Mediu specializat | Optimizat pentru cultivarea celulelor endoteliale |
| Testarea micoplasmelor | 900159 | Controlul calității | Esențial pentru detectarea contaminării cu micoplasmă în culturi |
| Autentificarea liniilor celulare - umane | 900154 | Controlul calității | Verifică identitatea liniilor celulare umane |
Acest tabel reprezintă o selecție de produse esențiale pentru cultura de celule de mamifere. Pentru gama noastră completă de produse pentru culturi celulare, inclusiv medii și reactivi specializați, vă rugăm să vizitați pagina noastră din categoria Medii și reactivi.
- o alternativă delicată la tripsină
Accutase este o soluție de disociere celulară care revoluționează industria culturilor celulare. Este un amestec de enzime proteolitice și colagenolitice care imită acțiunea tripsinei și a colagenazei. Spre deosebire de tripsină, Accutase nu conține componente de mamifere sau bacteriene și este mult mai blândă cu celulele, ceea ce o face o soluție ideală pentru detașarea de rutină a celulelor de pe materialele plastice standard pentru cultura țesuturilor și de pe materialele plastice acoperite cu aderență. În această postare pe blog, vom explora beneficiile și utilizările Accutase și modul în care acesta schimbă regulile jocului în cultura celulară.
Avantajele Accutase
Accutase are mai multe avantaje față de soluțiile tradiționale de tripsină. În primul rând, poate fi utilizat ori de câte ori este necesară detașarea blândă și eficientă a oricărei linii de celule aderente, ceea ce îl face un înlocuitor direct al tripsinei. În al doilea rând, Accutase funcționează extrem de bine pe celulele stem embrionare și neuronale și s-a demonstrat că menține viabilitatea acestor celule după transfer. În al treilea rând, Accutase păstrează majoritatea epitopilor pentru analiza citometrică în flux ulterioară, ceea ce o face ideală pentru analiza markerilor de suprafață celulară.
În plus, Accutase nu trebuie să fie neutralizat la trecerea celulelor aderente. Adăugarea mai multor medii după divizarea celulelor diluează Accutase astfel încât acesta nu mai este capabil să detașeze celulele. Acest lucru elimină necesitatea unei etape de inactivare și economisește timp pentru tehnicienii de culturi celulare. În cele din urmă, Accutase nu trebuie să fie alicotat, iar un flacon este stabil în frigider timp de 2 luni.
Aplicații ale Accutase
Accutase este un înlocuitor direct pentru soluția de tripsină și poate fi utilizat pentru trecerea liniilor celulare. În plus, Accutase funcționează bine la detașarea celulelor pentru analiza multor markeri de suprafață celulară prin citometrie în flux și pentru sortarea celulelor. Alte aplicații în aval ale tratamentului cu Accutase includ analiza markerilor de suprafață celulară, testul de creștere a virusurilor, proliferarea celulară, testele de migrare a celulelor tumorale, trecerea celulară de rutină, creșterea producției (bioreactor) și citometria în flux.
Compoziția Accutase
Accutase nu conține componente mamifere sau bacteriene și este un amestec enzimatic natural cu activitate enzimatică proteolitică și colagenolitică. Este formulat la o concentrație mult mai mică decât tripsina și colagenaza, ceea ce îl face mai puțin toxic și mai blând, dar la fel de eficient.
Eficiența Accutase
Accutase s-a dovedit a fi eficient în detașarea celulelor primare și stem și menținerea unei viabilități celulare ridicate în comparație cu enzimele de origine animală, cum ar fi tripsina. 100% din celule sunt recuperate după 10 minute și nu există niciun rău în lăsarea celulelor în Accutase timp de până la 45 de minute, datorită autodigestionării Accutase.
În concluzie
În concluzie, Accutase este o soluție puternică care schimbă regulile jocului în cultura celulară. Cu natura sa blândă, eficiența și versatilitatea sa, Accutase este alternativa ideală la tripsină. Dacă sunteți în căutarea unei soluții fiabile și eficiente pentru detașarea celulelor, Accutase este soluția pentru dumneavoastră.
Soluția salină tamponată cu fosfat (PBS) este o soluție tampon utilizată pe scară largă în cercetarea biologică și chimică. Aceasta joacă un rol crucial în menținerea echilibrului pH-ului și a osmolarității în timpul diferitelor proceduri experimentale, inclusiv prelucrarea țesuturilor și cultura celulară. Soluția noastră PBS este formulată meticulos cu ingrediente de înaltă puritate pentru a asigura stabilitatea și fiabilitatea în fiecare experiment. Osmolaritatea și concentrațiile de ioni ale soluției noastre PBS le imită îndeaproape pe cele ale corpului uman, făcând-o izotonică și netoxică pentru majoritatea celulelor.
Compoziția soluției noastre PBS
Soluția noastră PBS este un amestec cu pH ajustat de soluții tampon fosfat de calitate ultrapură și soluții saline. La o concentrație de lucru 1X, aceasta conține:
8000 mg/L clorură de sodiu (NaCl)
200 mg/L Clorură de potasiu (KCl)
1150 mg/L Fosfat de sodiu dibazic anhidru (Na2HPO4)
200 mg/L Fosfat de potasiu monobazic anhidru (KH2PO4)
Această compoziție asigură un pH optim și un echilibru ionic, adecvat pentru o gamă largă de aplicații biologice.
Aplicații ale soluției noastre PBS
Soluția noastră PBS este ideală pentru diverse aplicații în cercetarea biologică. Proprietățile sale izotonice și non-toxice o fac potrivită pentru diluarea substanțelor și clătirea recipientelor pentru celule. Soluțiile PBS care conțin EDTA sunt eficiente pentru desprinderea celulelor atașate și grupate. Cu toate acestea, metalele divalente, cum ar fi zincul, nu trebuie adăugate în PBS, deoarece pot provoca precipitații. În astfel de cazuri, sunt recomandate tampoanele Good. În plus, soluția noastră PBS este o alternativă acceptabilă la mediul de transport viral pentru transportul și depozitarea virușilor ARN, inclusiv SARS-CoV-2.
Controlul calității
Steril-filtrat
Depozitare și termen de valabilitate
A se păstra la +2°C până la +25°C, ferit de lumină.
Odată deschis, depozitați la o temperatură cuprinsă între 2°C și 25°C și utilizați în termen de 24 de luni.
Condiții de transport
Temperatură ambiantă
Întreținere
Păstrați la frigider la +2°C până la +8°C, în întuneric. Evitați înghețarea și încălzirea frecventă la +37°C, deoarece reduce calitatea produsului.
Nu încălziți mediul peste 37°C și nu utilizați surse de căldură necontrolate, cum ar fi aparatele cu microunde.
În cazul în care urmează să se utilizeze doar o parte din mediu, se îndepărtează cantitatea necesară și se încălzește la temperatura camerei înainte de utilizare.
Compoziție
Categoria
Componente
Concentrație (mg/L)
Săruri
Clorură de potasiu
200
Fosfat de potasiu monobazic anhidru
200
Clorură de sodiu
8000
Fosfat de sodiu dibazic anhidru
1150
Metoda de analiză
CLS oferă atât teste pe termen scurt, cât și pe termen lung pentru detectarea micoplasmei. În primul caz, probele sunt testate imediat după sosire, în timp ce în al doilea se inițiază cultura celulară, iar celulele sunt testate după 14 zile de cultivare fără antibiotice. Testarea micoplasmei se realizează utilizând un sistem de detecție în două puncte, atât cu PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen), cât și cu Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Eșantioane
Pentru testul rapid, vă rugăm să furnizați o suspensie celulară de minimum 50 µl conținând 50 000 de celule. Suspensia celulară poate fi expediată la temperatura ambiantă.
Pentru testul premium, vă rugăm să furnizați minimum 1 milion de celule într-un mediu de congelare adecvat pentru a asigura o cultură robustă și sănătoasă pentru cultivarea și testarea ulterioară a celulelor. Vă rugăm să expediați probele pe gheață carbonică.
Vă rugăm să completați Formularul de probă pentru testarea micoplasmei și să îl includeți la expedierea probei.
Test colorimetric Reporter
Acest test este un test colorimetric bazat pe celule. În prezența micoplasmei, o linie celulară reporter induce o cascadă de semnalizare care declanșează o schimbare de culoare în mediu de la roșu la albastru. Testul se efectuează în plăci multipuț cu 96 de godeuri. Semnalele sunt detectate într-un spectrofotometru pentru microplaci la 620-655 nm. Sunt detectate toate speciile mycoplasma și acholeplasma, dar și alți contaminanți din cultura celulară, cum ar fi bacteriile.
Amplificarea izotermă
Amplificarea izotermă este un test rapid și fiabil bazat pe amplificarea izotermă a ADN-ului specific micoplasmei, combinată cu detectarea în timp real cu ajutorul unui colorant de intercalare a ADN-ului. Testul este capabil să detecteze șase dintre cele mai comune specii care reprezintă > 95 % din contaminări: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis și A.laidlawii. Datorită omologiei secvențelor, vor fi detectate și alte specii de micoplasme (M.pneumoniae, M.gallisepticum și M.synoviae). Pentru a identifica dacă proba este pozitivă sau negativă pentru micoplasmă, se studiază temperatura de topire (Tm).
Concluzii: Rolul esențial al culturii de celule mamifere în cercetarea modernă
Cultura de celule de mamifere a revoluționat cercetarea biologică și medicală, oferind oamenilor de știință instrumente puternice pentru studierea proceselor celulare complexe, a mecanismelor bolilor și a intervențiilor terapeutice potențiale. De la izolarea celulelor primare la dezvoltarea de linii celulare imortalizate, această tehnică a devenit o parte indispensabilă a setului de instrumente științifice moderne
Drumul culturii de celule de mamifere începe cu tehnici atente de izolare, progresează prin menținerea meticuloasă a celulelor în medii specializate și culminează cu o gamă largă de aplicații în diferite domenii de studiu. Fie că este vorba de cercetarea cancerului, descoperirea de medicamente sau biologia celulară de bază, capacitatea de a crește și manipula celulele de mamifere in vitro a deschis căi fără precedent pentru explorarea științifică
Cheia succesului culturii de celule de mamifere sunt condițiile atent controlate în care sunt menținute celulele. De la compoziția mediului de creștere până la parametrii exacți de mediu din incubatoare, fiecare aspect este optimizat pentru a imita cât mai fidel posibil condițiile naturale ale celulelor. Această atenție la detalii asigură fiabilitatea și reproductibilitatea experimentelor, o piatră de temelie a bunei practici științifice
Dezvoltarea liniilor de celule imortalizate, cum ar fi celulele HeLa utilizate pe scară largă, a extins și mai mult posibilitățile de cultivare a celulelor. Aceste linii celulare oferă modele celulare coerente, ușor disponibile, care au accelerat cercetarea în numeroase discipline
Privind spre viitor, cultura de celule de mamifere continuă să evolueze. Progresele în tehnicile de cultură 3D, dezvoltarea organoizilor și utilizarea mediilor definite chimic depășesc limitele posibilităților în cultura celulară. Aceste evoluții promit să aducă modelele in vitro și mai aproape de complexitatea sistemelor in vivo, revoluționând potențial descoperirea de medicamente, medicina personalizată și înțelegerea biologiei umane
În concluzie, cultura de celule de mamifere rămâne o tehnică dinamică și esențială în cercetarea din domeniul științelor vieții. Perfecționarea și aplicarea sa continuă vor juca, fără îndoială, un rol crucial în abordarea unora dintre cele mai presante întrebări din biologie și medicină, stimulând progresul științific pentru anii următori