Celule primare umane

Ce sunt celulele primare umane?

Celulele primare sunt cea mai pură reprezentare a țesuturilor lor respective. Acestea sunt izolate din țesut și prelucrate astfel încât să se poată stabili într-un mediu de cultură cu condiții ideale. Ele imită mai bine starea in vivo și prezintă o fiziologie normală deoarece sunt derivate din țesut și nu modificate. Din acest motiv, ele pot servi drept modele utile pentru cercetarea în domeniul farmacologiei celulare, toxicologiei și fiziologiei (inclusiv studii privind metabolismul, îmbătrânirea și transducția semnalelor). Rețineți că este mai dificil să cultivați și să mențineți celulele primare decât o linie celulară continuă, deoarece acestea au o durată de viață mai scurtă și se vor opri din diviziune (sau senescență) după un anumit număr de diviziuni celulare. Studiile privind căile de semnalizare celulară sunt complicate de variabilitatea inerentă a celulelor primare obținute de la donatori și prin practici de subcultură. Înainte de a începe studiile de semnalizare, cercetătorii efectuează adesea un screening pentru a determina dacă celulele răspund sau nu la stimulii utilizați în mod obișnuit. Pentru a evita pierderea de timp și de bani, celulele primare pot fi stimulate pentru a activa principalele căi de semnalizare înainte de a fi supuse screeningului.

De ce să folosim celule primare umane?

Liniile de celule imortalizate sunt utilizate în mod obișnuit ca test celular. Deși oamenii de știință au recunoscut că modificările biologice datorate liniilor celulare pot fi dăunătoare în studiul semnificației lor fiziologice. Utilizarea celulelor primare umane îmbunătățește valoarea fiziologică a datelor obținute prin culturi celulare și sunt considerate din ce în ce mai importante pentru studiul proceselor biologice, evoluția bolilor și dezvoltarea medicamentelor.

Celulele primare umane sunt utilizate pe scară largă în studiile in vitro privind comunicarea intercelulară și intracelulară, biologia dezvoltării și mecanismele care stau la baza cancerului, bolii Parkinson și diabetului, printre multe alte domenii de cercetare biologică preclinică și investigativă. Cercetătorii au utilizat mult timp linii de celule imortalizate pentru a studia funcția țesuturilor; cu toate acestea, liniile de celule cu mutații evidente și anomalii cromozomiale pot să nu fie surogate bune pentru celulele normale și pentru dezvoltarea bolii în stadiile sale incipiente. Un model mai precis al unui anumit tip de celule tisulare poate fi obținut în prezent prin utilizarea de celule primare umane izolate din țesutul respectiv și menținute în medii și suplimente de cultură celulară primară.

Ce este cultura celulară primară?

În loc să utilizeze linii celulare imortalizate, cultura celulară primară implică cultivarea de celule direct dintr-un organism pluricelular din afara corpului. În unele țări, cum ar fi Regatul Unit, există o recunoaștere legală a faptului că culturile de celule primare sunt mai reprezentative pentru țesuturile in vivo decât liniile celulare. Cu toate acestea, celulele primare au nevoie de substratul și substanțele nutritive adecvate pentru a se dezvolta și, după un anumit număr de diviziuni, ele dezvoltă un fenotip senescent care le determină să se oprească definitiv din diviziune. Acești doi factori motivează crearea de linii celulare. Atât celulele primare imortalizate natural (de exemplu, celulele HeLa), cât și celulele primare imortalizate artificial (de exemplu, celulele HEK) pot fi cultivate pe termen nelimitat în culturi celulare.

Celule primare umane pe tipuri de țesuturi

Celulele epiteliale, fibroblastele, keratinocitele, melanocitele, celulele endoteliale, celulele musculare, celulele imune și celulele stem precum celulele stem mezenchimale se numără printre cele mai frecvent utilizate celule primare umane în studiile științifice. Pentru început, culturile sunt eterogene (reprezentând un amestec de tipuri de celule prezente în țesut) și pot fi menținute în viață in vitro doar pentru o anumită perioadă de timp. Transformarea este un proces in vitro care permite manipularea celulelor primare umane pentru subculturi nelimitate. Transformarea poate avea loc în mod natural sau poate fi indusă de substanțe chimice sau viruși. După ce a fost supusă transformării genetice, o cultură primară se poate diviza pe termen nelimitat într-o linie celulară secundară imortalizată, dacă i se oferă suficiente substanțe nutritive și spațiu.

Celule endoteliale

Tratamentul cancerului, vindecarea rănilor, cercetarea semnalizării celulare, screeningul de mare capacitate și conținut și screeningul toxicologic sunt doar câteva dintre domeniile care pot beneficia de utilizarea celulelor endoteliale primare ca instrument de cercetare.

Keratinocitele

Keratinocitele, derivate din epiderma pielii umane adulte sau a prepuțului neonatal, joacă un rol crucial în studiul bolilor de piele precum psoriazisul și cancerul.

Celule epiteliale

De la studiile privind cancerul la investigațiile toxicologice, celulele epiteliale primare s-au dovedit a fi resurse inestimabile pentru modelarea apărării naturale a organismului.

Fibroblaste

Inducerea celulelor stem pluripotente (iPS) și studiul vindecării rănilor sunt doar câteva dintre numeroasele utilizări ale fibroblastelor primare.

Celule imune

Celulele mononucleare din sângele periferic, pe scurt PBMC, sunt celule mononucleare ale sângelui cu un nucleu celular rotund. Acestea includ în principal limfocite și monocite, care preiau funcții importante în cursul unui răspuns imun. Celulele mononucleare din sângele periferic sunt adesea utilizate pentru diagnosticarea infecțiilor sau pentru detectarea unei posibile protecții prin vaccinare. Înțelegerea răspunsului imun celular mediat de celulele T este adesea crucială.

Melanocitele

Melanocitele, celulele specializate ale pielii care produc pigmentul melanină, sunt utile ca modele pentru cercetarea unor subiecte precum vindecarea rănilor, toxicitatea, melanomul, răspunsul dermic la radiațiile ultraviolete (UV), bolile pielii și produsele cosmetice.

Celule stem

Celulele stem au potențialul de a se diferenția într-o mare varietate de tipuri de celule. Datorită capacității lor de diferențiere, ele oferă noi oportunități de modelare a țesuturilor umane și a stărilor de sănătate.

Celule stem mezenchimale

Celulele stem mezenchimale, cunoscute și sub denumirea de CSM, pot fi obținute din diferite surse umane, cum ar fi măduva osoasă, grăsimea (țesutul adipos), țesutul cordonului ombilical (gelatina Wharton) și lichidul amniotic (lichidul care înconjoară un făt) și pot fi expandate in vitro. Aceste celule stem stromale adulte au capacitatea de a se dezvolta într-o mare varietate de tipuri de celule. Unele dintre aceste tipuri de celule includ celule osoase, celule cartilaginoase, celule musculare, celule neurale, celule cutanate și celule corneene.

Celulele musculare netede

În interiorul organelor goale, celulele musculare netede primare (SMC) căptușesc interiorul și mediază contractilitatea. În plus față de cancer și alte boli, SMC pot fi utilizate pentru a modela fibroza hipertensivă.

Celule primare și linii celulare

Fie prin mutație spontană, ca în cazul liniilor celulare canceroase transformate, fie prin alterare intenționată, ca în cazul producției artificiale de gene canceroase, liniile celulare continue au dobândit potențialul de a se reproduce la nesfârșit (imortalizate). De regulă, liniile celulare continue sunt mai fiabile și mai ușor de utilizat decât celulele primare. Ele se pot extinde la nesfârșit și oferă acces rapid la date esențiale. Utilizarea liniilor celulare continue are anumite limitări, inclusiv faptul că acestea sunt modificate/transformate genetic, ceea ce ar putea schimba caracteristicile fiziologice și nu ar corespunde stării in vivo, și că acest lucru se poate schimba și mai mult în timp cu o trecere semnificativă.

Progrese în cultura celulelor primare

Celulele primare au reputația notorie de a fi dificil de lucrat cu ele. Cu toate acestea, procesul devine mai ușor ca niciodată datorită evoluțiilor în domeniul culturii de celule primare, a disponibilității celulelor primare comerciale cu protocoale complet optimizate și a noilor tehnici de analiză care necesită mai puține resurse.

Trecerea de la cultura celulară bidimensională la cea tridimensională este considerată o etapă majoră în domeniu. Arhitectura specifică țesuturilor, interacțiunile celulă-celulă și semnalizarea mecanică/biochimică pot fi atenuate într-o cultură 2D. Astfel, valoarea biologică a acestor culturi este limitată.

Pe de altă parte, cultura celulară 3D permite celulelor să se extindă și să interacționeze cu un cadru extracelular 3D. Acest lucru permite celulelor să interacționeze între ele și cu matricea extracelulară, făcând culturile 3D mai relevante din punct de vedere fiziologic. Precizia acestei metode în prezicerea răspunsurilor in vivo a făcut-o revoluționară în domenii precum descoperirea și dezvoltarea medicamentelor. Din acest motiv, tehnologiile de ultimă oră, cum ar fi organoizii derivați de la pacienți și organele pe cip, oferă modele extrem de contextuale pentru depistarea și dezvoltarea medicamentelor.

Generarea de celule primare reprezintă un blocaj în cultura primară. Un volum mai mare de țesut este de obicei necesar pentru a depăși această problemă, ceea ce poate fi dificil de realizat. Cu toate acestea, sensibilitatea analitică îmbunătățită oferă o cale de urmat. De exemplu, necesitatea de a cultiva cantități mari de celule primare este redusă prin utilizarea tehnologiei monocelulare, care include secvențierea, Western Blotting și citometria de masă.

Perspective promițătoare pentru cultura de celule primare

Dificultățile generale ale culturii de celule primare sunt atenuate de progresele tehnologice. În schimb, această metodă le înlocuiește rapid pe celelalte ca standard de aur în studiul și practica biologiei celulare și moleculare. Producția de vaccinuri, înlocuirea de organe, terapiile cu celule stem, cercetarea cancerului și multe altele vor beneficia foarte mult de pe urma progreselor continue ale culturii de celule primare.

Sfaturi și trucuri privind cultura celulară primară

Necesitățile de expansiune celulară

Cele mai comune două metode de cultivare a celulelor primare sunt în suspensie sau pe o suprafață (2D). Unele celule sunt capabile să plutească liber în fluxul sanguin fără a deveni vreodată aderente la o suprafață (de exemplu, cele derivate din sângele periferic). Diferite linii de celule au fost modificate pentru a se dezvolta în culturi în suspensie, unde pot atinge densități care nu pot fi atinse în condiții de creștere 2D. Celulele primare care au nevoie de ancorare pentru a se dezvolta in vitro sunt numite celule aderente și le includ pe cele care se găsesc în țesuturile solide. Pentru a îmbunătăți proprietățile de aderență și pentru a furniza alte semnale necesare pentru creștere și diferențiere, aceste celule sunt de obicei cultivate într-un vas plat din plastic neacoperit, dar ocazional și într-un micro-suport. Aceasta din urmă opțiune poate fi acoperită cu proteine ale matricei extracelulare (cum ar fi colagenul și laminina). Mediul utilizat în cultura celulară constă într-un mediu de bază care a fost suplimentat cu factorii de creștere și citokinele corespunzătoare. Incubatorul de celule este un tip special de incubator de laborator utilizat pentru cultivarea și menținerea celulelor la o anumită temperatură și la un anumit amestec de gaze (de obicei 37 °C, 5% CO2 pentru celulele mamiferelor). În funcție de tipul de celule cultivate, condițiile optime pot fi foarte diferite. În funcție de tipurile de celule cultivate, mediul de creștere optim va avea o combinație unică de factori, inclusiv, dar fără a se limita la pH, concentrația de glucoză, factorii de creștere și prezența altor nutrienți.

Antibioticele din mediul de creștere sunt esențiale în timpul stabilirii culturii primare pentru a preveni contaminarea din țesutul gazdă. Unele regimuri de antibiotice includ o combinație de gentamicină, penicilină, streptomicină și amfotericină B. Cu toate acestea, utilizarea antibioticelor pentru o perioadă îndelungată de timp nu este recomandată, deoarece unii reactivi (cum ar fi amfotericina B) pot fi toxici pentru celule pe termen lung.

Majoritatea celulelor primare trec prin senescență și încetează să se dividă după un anumit număr de dublări ale populației, ceea ce face esențială menținerea lor în viață după izolare. Viabilitatea celulelor pe termen lung necesită tehnici specializate de cultivare a celulelor și condiții ideale de cultură (inclusiv mediul potrivit, temperatura potrivită, amestecul de gaze potrivit, pH-ul potrivit, concentrația potrivită de factori de creștere, prezența nutrienților și prezența glucozei). Deoarece mulți dintre factorii de creștere utilizați pentru suplimentarea mediului sunt obținuți din sânge animal (ingredientele derivate din sânge posedă potențial de contaminare), se recomandă ca utilizarea acestora să fie redusă la minimum sau evitată cu totul. De asemenea, este important să se utilizeze o tehnică aseptică.

Subcultura și întreținerea

Când celulele izolate aderă la suprafața vasului de cultură, aceasta marchează începutul fazei de întreținere. Atașarea are loc de obicei la 24 de ore după inițierea culturii. Celulele trebuie subcultivate atunci când au atins un anumit procent de confluență și se replică activ. Deoarece celulele post-confluente pot suferi diferențiere și pot prezenta o proliferare mai lentă după trecere, este mai bine să se facă subcultura culturilor de celule primare înainte ca acestea să ajungă la 100% confluență.

Subculturile în medii proaspete mențin creșterea exponențială a celulelor dependente de ancorare. Monostraturile de subcultură perturbă interacțiunile inter și intracelulare ale suprafeței celulare. Concentrații scăzute de enzime proteolitice, cum ar fi tripsina/EDTA, sunt utilizate pentru a extrage celulele primare aderente din straturi monolitice sau țesuturi. După disociere și diluare într-o soluție unicelulară, celulele sunt numărate și transferate în recipiente de cultură noi pentru a se reatașa și înmulți.

Crioprezervarea și recuperarea

Crioconservarea păstrează celulele vii prin înghețarea lor la temperaturi scăzute. Crioprezervarea și decongelarea celulelor primare umane previne moartea și deteriorarea celulelor în timpul depozitării și utilizării. Celulele primare umane sunt crioprotejate folosind DMSO sau glicerol (la temperatura corectă și cu o rată controlată de congelare). Procesul de congelare trebuie să fie progresiv, la -1 °C în fiecare minut, pentru a preveni formarea cristalelor de gheață. Stocarea pe termen lung necesită azot lichid (-196 °C) sau temperaturi sub -130 °C.

Pentru a dezgheța celulele crioconservate, este suficientă scufundarea celulelor congelate într-o baie de apă la 37 °C timp de 1-2 minute. Celulele primare umane nu trebuie centrifugate după decongelare din congelator (deoarece sunt extrem de sensibile la deteriorare în timpul recuperării din crioconservare). Este potrivit pentru însămânțarea celulelor imediat după decongelare și promovează atașarea în culturi în primele 24 de ore după însămânțare. 1 După atașarea celulelor primare crioconservate, mediul uzat trebuie îndepărtat (deoarece DMSO este nociv pentru celulele primare și poate provoca o scădere a viabilității după dezghețare).