Celule primare umane

Ce sunt celulele primare umane?

Celulele primare reprezintă cea mai pură formă a țesuturilor din care provin. Acestea sunt izolate din țesut și prelucrate astfel încât să se poată stabili într-un mediu de cultură cu condiții ideale. Acestea imită mai fidel starea in vivo și prezintă o fiziologie normală, deoarece sunt derivate din țesut, nu sunt modificate. Din acest motiv, ele pot servi drept modele utile pentru cercetarea în domeniul farmacologiei celulare, toxicologiei și fiziologiei (inclusiv studii privind metabolismul, îmbătrânirea și transducția semnalelor). Trebuie reținut faptul că celulele primare sunt mai dificil de cultivat și de întreținut decât o linie celulară continuă, deoarece au o durată de viață mai scurtă și încetează să se mai dividă (sau senesc) după un anumit număr de diviziuni celulare. Studiile privind căile de semnalizare celulară sunt complicate de variabilitatea inerentă a celulelor primare obținute de la donatori și prin practicile de subcultivare. Înainte de a începe studiile privind semnalizarea, cercetătorii efectuează adesea o selecție pentru a determina dacă celulele răspund sau nu la stimulii utilizați în mod obișnuit. Pentru a evita pierderea de timp și bani, celulele primare pot fi stimulate pentru a activa principalele căi de semnalizare înainte de a fi supuse selecției.

De ce se utilizează celule primare umane?

Liniile celulare imortalizate sunt utilizate în mod obișnuit ca model de analiză celulară. Cu toate acestea, oamenii de știință au recunoscut că modificările biologice datorate liniilor celulare pot fi dăunătoare în studierea semnificației lor fiziologice. Utilizarea celulelor primare umane îmbunătățește valoarea fiziologică a datelor obținute prin culturi celulare, iar acestea sunt considerate din ce în ce mai importante pentru studierea proceselor biologice, a evoluției bolilor și a dezvoltării medicamentelor.

Celulele primare umane sunt utilizate pe scară largă în studiile in vitro privind comunicarea intercelulară și intracelulară, biologia dezvoltării și mecanismele care stau la baza cancerului, bolii Parkinson și diabetului, printre multe alte domenii de cercetare biologică preclinică și investigativă. Cercetătorii au folosit de mult timp linii celulare imortalizate pentru a studia funcția țesuturilor; cu toate acestea, liniile celulare cu mutații evidente și anomalii cromozomiale pot să nu fie substitute adecvate pentru celulele normale și pentru evoluția bolii în stadiile sale incipiente. În prezent, se poate obține un model mai precis al unui tip specific de celule tisulare prin utilizarea celulelor primare umane izolate din țesutul respectiv și menținute în medii de cultură celulară primară și suplimente.

Ce este cultura de celule primare?

În locul utilizării liniilor celulare imortalizate, cultura de celule primare implică cultivarea directă a celulelor provenite dintr-un organism multicelular în afara corpului. În unele țări, precum Regatul Unit, există o recunoaștere legală a faptului că culturile de celule primare sunt mai reprezentative pentru țesuturile in vivo decât liniile celulare. Cu toate acestea, celulele primare au nevoie de substratul și nutrienții potriviți pentru a crește, iar după un anumit număr de diviziuni, ele dezvoltă un fenotip senescent care le determină să înceteze definitiv diviziunea. Acești doi factori stau la baza creării liniilor celulare. Atât celulele primare imortalizate natural (de exemplu, celulele HeLa), cât și celulele primare imortalizate artificial (de exemplu, celulele HEK) pot fi cultivate pe termen nelimitat în cultură celulară.

Celule primare umane în funcție de tipul de țesut

Celulele epiteliale, fibroblastele, keratinocitele, melanocitele, celulele endoteliale, celulele musculare, celulele imune și celulele stem, precum celulele stem mezenchimale, se numără printre cele mai frecvent utilizate celule primare umane în studiile științifice. În primul rând, culturile sunt eterogene (reprezentând un amestec de tipuri de celule prezente în țesut) și pot fi menținute în viață in vitro doar pentru o anumită perioadă de timp. Transformarea este un proces in vitro care permite manipularea celulelor primare umane pentru subculturi nelimitate. Transformarea poate avea loc în mod natural sau poate fi indusă de substanțe chimice sau viruși. După ce a suferit o transformare genetică, o cultură primară se poate divide la nesfârșit, dând naștere unei linii celulare secundare imortalizate, dacă i se asigură suficienți nutrienți și spațiu.

Celulele endoteliale

Tratamentul cancerului, vindecarea rănilor, cercetarea în domeniul semnalizării celulare, screeningul de mare capacitate și cu conținut ridicat, precum și screeningul toxicologic sunt doar câteva dintre domeniile care pot beneficia de utilizarea celulelor endoteliale primare ca instrument de cercetare.

Keratinocite

Keratinocitele, derivate din epiderma pielii umane adulte sau din preputul neonatal, joacă un rol crucial în studiul bolilor de piele, cum ar fi psoriazisul și cancerul.

Celule epiteliale

De la studiile privind cancerul până la investigațiile toxicologice, celulele epiteliale primare s-au dovedit a fi resurse de neprețuit pentru modelarea mecanismelor naturale de apărare ale organismului.

Fibroblaste

Inducerea celulelor stem pluripotente (iPS) și studierea procesului de vindecare a rănilor sunt doar câteva dintre numeroasele utilizări ale fibroblastelor primare.

Celule imune

Celulele mononucleare din sângele periferic, denumite pe scurt PBMC, sunt celule mononucleare din sânge cu nucleu rotund. Acestea includ în principal limfocite și monocite, care îndeplinesc funcții importante în cursul unui răspuns imun. Celulele mononucleare din sângele periferic sunt adesea utilizate pentru diagnosticarea infecțiilor sau pentru detectarea unei posibile protecții conferite de vaccinare. Înțelegerea răspunsului imun celular mediat de celulele T este adesea crucială.

Melanocitele

Melanocitele, celulele specializate ale pielii care produc pigmentul melanină, sunt utile ca modele pentru cercetarea unor teme precum vindecarea rănilor, toxicitatea, melanomul, răspunsul dermic la radiațiile ultraviolete (UV), bolile de piele și produsele cosmetice.

Celulele stem

Celulele stem au potențialul de a se diferenția într-o mare varietate de tipuri de celule. Datorită capacității lor de diferențiere, acestea oferă noi oportunități pentru modelarea țesuturilor umane și a afecțiunilor de sănătate.

Celule stem mezenchimale

Celulele stem mezenchimale, cunoscute și sub denumirea de MSC, pot fi obținute din diverse surse umane, precum măduva osoasă, țesutul adipos, țesutul cordonului ombilical (gelatina lui Wharton) și lichidul amniotic (lichidul care înconjoară fătul) și pot fi multiplicate in vitro. Aceste celule stem stromale adulte au capacitatea de a se dezvolta într-o mare varietate de tipuri de celule. Printre aceste tipuri de celule se numără celulele osoase, celulele cartilaginoase, celulele musculare, celulele neuronale, celulele cutanate și celulele corneene.

Celulele musculare netede

În interiorul organelor cavitare, celulele musculare netede primare (SMC) căptușesc interiorul și asigură contractilitatea. Pe lângă cancer și alte boli, SMC pot fi utilizate pentru a modela fibroza hipertensivă.

Celule primare și linii celulare

Fie prin mutație spontană, ca în cazul liniilor celulare canceroase transformate, fie prin alterare intenționată, ca în cazul producerii artificiale a genelor canceroase, liniile celulare continue au dobândit potențialul de a se reproduce la nesfârșit (imortalizate). De regulă, liniile celulare continue sunt mai fiabile și mai ușor de manipulat decât celulele primare. Acestea se pot multiplica la nesfârșit și oferă acces rapid la date esențiale. Utilizarea liniilor celulare continue prezintă anumite limitări, inclusiv faptul că sunt modificate/transformate genetic, ceea ce ar putea modifica caracteristicile fiziologice și ar putea să nu corespundă condițiilor in vivo, iar acest lucru se poate modifica în continuare în timp, odată cu repetarea pasajelor.

Progrese în cultura celulelor primare

Celulele primare au o reputație notorie de a fi dificil de lucrat cu ele. Procesul devine însă mai ușor ca niciodată datorită evoluțiilor din domeniul culturii celulare primare, disponibilității celulelor primare comerciale cu protocoale complet optimizate și noilor tehnici de analiză care necesită mai puțin efort.

Trecerea de la cultura celulară bidimensională la cea tridimensională este considerată o etapă importantă în acest domeniu. Arhitectura specifică țesutului, interacțiunile celulă-celulă și semnalizarea mecanică/biochimică pot fi atenuate într-o cultură 2D. Prin urmare, valoarea biologică a acestor culturi are o limită maximă.

Pe de altă parte, cultura celulară 3D permite celulelor să se extindă și să interacționeze cu o structură extracelulară tridimensională. Acest lucru permite celulelor să interacționeze între ele și cu matricea extracelulară, făcând culturile 3D mai relevante din punct de vedere fiziologic. Precizia acestei metode în prezicerea răspunsurilor in vivo a făcut-o revoluționară în domenii precum descoperirea și dezvoltarea medicamentelor. Din acest motiv, tehnologiile de ultimă generație, precum organoidele derivate de la pacienți și „organele pe cip”, oferă modele extrem de contextuale pentru screeningul și dezvoltarea medicamentelor.

Generarea celulelor primare reprezintă un punct de blocaj în cultura primară. De obicei, este necesar un volum mai mare de țesut pentru a depăși această problemă, ceea ce poate fi dificil de obținut. Cu toate acestea, sensibilitatea analitică îmbunătățită oferă o cale de urmat. De exemplu, necesitatea de a cultiva cantități mari de celule primare este redusă prin utilizarea tehnologiei celulare unice, care include secvențierea, western blotting și citometria de masă.

Perspective promițătoare pentru cultura de celule primare

Dificultățile generale ale culturii de celule primare sunt atenuate de progresele tehnologice. La rândul său, această metodă înlocuiește rapid alte metode, devenind standardul de referință în studiul și practica biologiei celulare și moleculare. Producția de vaccinuri, înlocuirea organelor, terapiile cu celule stem, cercetarea în domeniul cancerului și multe alte domenii vor beneficia în mare măsură de progresele continue în cultura de celule primare.

Sfaturi și trucuri pentru cultura celulelor primare

Necesitățile legate de multiplicarea celulară

Cele două metode cele mai comune de cultivare a celulelor primare sunt în suspensie sau pe o suprafață (2D). Unele celule sunt capabile să plutească liber în fluxul sanguin fără a adera vreodată la o suprafață (de exemplu, cele derivate din sângele periferic). Au fost create diferite linii celulare pentru a se dezvolta în culturi în suspensie, unde pot atinge densități imposibil de obținut în condiții de creștere 2D. Celulele primare care au nevoie de ancorare pentru a crește in vitro sunt numite celule aderente și includ cele găsite în țesuturile solide. Pentru a îmbunătăți proprietățile de aderență și a furniza alte semnale necesare creșterii și diferențierii, aceste celule sunt de obicei cultivate într-un recipient plat din plastic neacoperit, dar ocazional pe un micro-suport. Această din urmă opțiune poate fi acoperită cu proteine ale matricei extracelulare (cum ar fi colagenul și laminina). Mediul utilizat în cultura celulară constă dintr-un mediu de bază care a fost suplimentat cu factorii de creștere și citokinele corespunzătoare. Un incubator celular este un tip special de incubator de laborator utilizat pentru cultivarea și menținerea celulelor la o temperatură specifică și un amestec de gaze specific (de obicei 37 °C, 5% CO₂ pentru celulele de mamifere). În funcție de tipul de celule cultivate, condițiile optime pot varia semnificativ. În funcție de tipurile de celule cultivate, mediul de creștere optim va avea o combinație unică de factori, incluzând, dar fără a se limita la, pH-ul, concentrația de glucoză, factorii de creștere și prezența altor nutrienți.

Antibioticele din mediul de creștere sunt esențiale în timpul stabilirii culturii primare pentru a preveni contaminarea din țesutul gazdă. Unele regimuri antibiotice includ o combinație de gentamicină, penicilină, streptomicină și amfotericină B. Utilizarea antibioticelor pe o perioadă îndelungată nu este însă recomandată, deoarece unii reactivi (cum ar fi amfotericina B) pot fi toxici pentru celule pe termen lung.

Majoritatea celulelor primare trec prin senescență și încetează să se mai dividă după un anumit număr de dublări ale populației, ceea ce face esențială menținerea lor în viață după izolare. Viabilitatea celulară pe termen lung necesită tehnici specializate de cultivare celulară și condiții ideale de cultură (inclusiv mediul adecvat, temperatura corespunzătoare, amestecul de gaze adecvat, pH-ul corespunzător, concentrația corespunzătoare de factori de creștere, prezența nutrienților și prezența glucozei). Deoarece mulți dintre factorii de creștere utilizați pentru a suplimenta mediile de cultură sunt obținuți din sânge animal (ingredientele derivate din sânge prezintă un potențial de contaminare), se recomandă ca utilizarea acestora să fie redusă la minimum sau evitată cu totul. De asemenea, este important să se utilizeze o tehnică aseptică.

Subcultivarea și întreținerea

Atunci când celulele izolate aderă la suprafața vasului de cultură, acest lucru marchează începutul fazei de întreținere. Aderarea are loc, de obicei, la 24 de ore după inițierea culturii. Celulele trebuie subcultivate atunci când au atins un anumit procent de confluență și se replică activ. Deoarece celulele post-confluente pot suferi diferențiere și pot prezenta o proliferare mai lentă după pasaj, este recomandat să se efectueze subcultivarea culturilor de celule primare înainte ca acestea să atingă 100% confluență.

Subcultivarea în medii proaspete menține creșterea exponențială a celulelor dependente de ancorare. Subcultivarea monostraturilor perturbă interacțiunile inter- și intracelulare de la suprafața celulară. Se utilizează concentrații scăzute de enzime proteolitice, precum tripsina/EDTA, pentru a extrage celulele primare aderente din monostraturi sau țesuturi. După disociere și diluare într-o soluție de celule individuale, celulele sunt numărate și transferate în recipiente de cultură proaspete pentru a se reatașa și a se multiplica.

Crioconservarea și recuperarea

Crioconservarea păstrează celulele vii prin congelarea acestora la temperaturi scăzute. Crioconservarea și decongelarea celulelor primare umane previn moartea și deteriorarea celulelor în timpul depozitării și utilizării. Celulele primare umane sunt crioprotejate folosind DMSO sau glicerol (la temperatura corectă și cu o viteză controlată de congelare). Procesul de congelare trebuie să fie progresiv, cu o scădere de -1 °C pe minut, pentru a preveni formarea cristalelor de gheață. Depozitarea pe termen lung necesită azot lichid (-196 °C) sau temperaturi sub -130 °C.

Pentru decongelarea celulelor crioconservate este suficientă scufundarea celulelor congelate într-o baie de apă la 37 °C timp de aproximativ 1-2 minute. Celulele primare umane nu trebuie centrifugate după decongelarea din congelator (deoarece sunt extrem de sensibile la deteriorare în timpul recuperării din crioconservare). Este adecvat pentru însămânțarea celulelor imediat după decongelare și favorizează atașarea în culturi în primele 24 de ore după însămânțare. 1 După ce celulele primare crioconservate s-au atașat, mediul uzat trebuie îndepărtat (deoarece DMSO este dăunător pentru celulele primare și poate provoca o scădere a viabilității post-decongelare).