Publicado: 2023 | Última revisão: maio de 2026

Técnicas de dissociação de culturas celulares

A dissociação de culturas celulares é uma etapa crítica na manutenção de culturas celulares. Envolve a separação das células da sua superfície de crescimento para permitir a subcultura ou a colheita. Esta secção descreve dois métodos principais: a utilização de tampões de dissociação sem enzimas e a utilização de reagentes enzimáticos.

Utilização de tampões de dissociação celular sem enzimas

Este método é suave e mantém a integridade celular sem o uso de enzimas:

1. Preparação
   • Certifique-se de que todos os reagentes estão aquecidos a 37 °C antes da utilização, para evitar um choque nas células.
2. Remoção do meio de crescimento:
   • Descarte o meio de crescimento antigo do recipiente de cultura.
3. Enxaguamento
   • Lave as monocamadas celulares com 5 ml de PBS sem cálcio e magnésio por frasco T75 ou placa de 100 mm.
   • Agite suavemente o recipiente durante 30 a 60 segundos à temperatura ambiente.
   • Aspire e descarte a solução de enxaguamento.
   • Repita este passo de enxaguamento mais uma vez.
4. Dissociação
   • Adicione aproximadamente 5 ml de tampão de dissociação celular isento de enzimas ao recipiente.
   • Agite suavemente à temperatura ambiente durante 1 a 2 minutos e verifique a dissociação ao microscópio.
   • Bata o frasco ou a placa contra a mão para soltar as células, se necessário.
   • Se as células estiverem aderentes, deixe-as repousar à temperatura ambiente durante mais 2 a 5 minutos e bata novamente, se necessário, utilizando mais tampão de dissociação.
   • Assim que as células estiverem desprendidas, adicione pelo menos 5 ml de meio de crescimento completo para neutralizar o tampão de dissociação e ressuspender as células.
5. Verificação da viabilidade
   • Monitorize a viabilidade celular durante a subcultura, garantindo que se mantém acima dos 90%.

Utilização de outros reagentes para a dissociação

Este método permite a utilização de vários reagentes de dissociação:

1. Remoção do meio usado
   • Descarte o meio antigo do recipiente de cultura.
2. Lavagem das células
   • Lave as células com uma solução salina equilibrada isenta de cálcio e magnésio, ou utilize EDTA.
   • Adicione a solução de lavagem suavemente pelo lado oposto às células e agite o recipiente durante 1 a 2 minutos antes de descartar a solução de lavagem.
3. Dissociação
   • Aplique 2 a 3 ml da solução de dissociação escolhida por cada 25 cm² de superfície de crescimento, garantindo a cobertura da camada celular.
   • Incube o recipiente a 37 °C e agite suavemente. A dissociação ocorre normalmente dentro de 5 a 15 minutos, dependendo da linha celular.
   • Para células resistentes, bater levemente no recipiente pode acelerar o processo.
   • Observe as células cuidadosamente para evitar a sobreexposição e possíveis danos.
4. Recolha de células
   • Assim que as células estiverem totalmente desprendidas, deixe-as acumular-se no fundo do recipiente, colocando-o na vertical.
   • Adicione meio completo, depois disperse e recolha as células pipetando sobre a camada celular.
   • Conte as células e prossiga com a subcultura.

Em ambos os métodos, é importante determinar as condições ideais para cada linha celular através da observação empírica. O processo deve preservar a viabilidade celular, que deve ser verificada rotineiramente para garantir que exceda 90% durante a subcultura. Estes procedimentos fornecem uma base para que os investigadores se adaptem com base nos requisitos e características específicos das suas linhas celulares.

Visão geral das técnicas para subcultura de células aderentes

A subcultura eficaz de células aderentes requer o seu desprendimento do recipiente de cultura. São utilizados vários métodos, cada um adequado a diferentes tipos de células e condições. Ao selecionar um método de dissociação, é crucial considerar as necessidades específicas da linha celular e os objetivos da experiência. A monitorização regular da viabilidade celular, com o objetivo de atingir mais de 90% no momento da subcultura, é essencial para a saúde e produtividade contínuas da cultura. Aqui está uma visão geral destes procedimentos: