Técnicas de dissociação de culturas celulares

A dissociação da cultura celular é um passo crítico na manutenção da cultura celular. Envolve a separação das células da sua superfície de crescimento para permitir a subcultura ou a colheita. Esta secção descreve dois métodos principais: utilização de tampões de dissociação sem enzimas e utilização de reagentes enzimáticos.

1.utilização de tampões de dissociação celular sem enzimas

Este método é suave e mantém a integridade celular sem a utilização de enzimas:

1. Preparação
   • Assegurar que todos os reagentes são aquecidos a 37°C antes da utilização para evitar o choque nas células.
2. Remoção do meio de crescimento
   • Eliminar o meio de crescimento antigo do recipiente de cultura.
3. Enxaguamento
   • Lavar as monocamadas de células com 5 ml de PBS sem cálcio e magnésio por frasco T75 ou placa de 100 mm.
   • Agitar suavemente o recipiente durante 30 a 60 segundos à temperatura ambiente.
   • Aspirar e deitar fora a solução de lavagem.
   • Repetir este passo de lavagem mais uma vez.
4. Dissociação
   • Adicionar aproximadamente 5 ml de tampão de dissociação celular sem enzimas ao recipiente.
   • Agitar suavemente à temperatura ambiente durante 1 a 2 minutos e verificar a dissociação ao microscópio.
   • Se necessário, bater com o frasco ou a placa contra a mão para deslocar as células.
   • Se as células estiverem aderentes, deixar repousar à temperatura ambiente durante mais 2 a 5 minutos e bater novamente, se necessário, utilizando mais tampão de dissociação.
   • Quando as células estiverem descoladas, adicionar pelo menos 5 ml de meio de crescimento completo para neutralizar o tampão de dissociação e ressuspender as células.
5. Controlo da viabilidade
   • Monitorizar a viabilidade celular durante a subcultura, assegurando que se mantém acima de 90%.

2.utilização de outros reagentes para dissociação

Este método permite a utilização de vários reagentes de dissociação:

1. Remoção do meio usado
   • Eliminar o meio antigo do recipiente de cultura.
2. Lavagem das células
   • Lavar as células com uma solução salina equilibrada, isenta de cálcio e magnésio, ou utilizar EDTA.
   • Adicionar a solução de lavagem suavemente ao lado oposto ao das células e agitar o recipiente durante 1 a 2 minutos antes de deitar fora a lavagem.
3. Dissociação
   • Aplicar 2 a 3 ml da solução de dissociação selecionada por 25 cm² de superfície de crescimento, assegurando a cobertura da folha de células.
   • Incubar o recipiente a 37°C e agitar suavemente. A dissociação ocorre normalmente num período de 5 a 15 minutos, dependendo da linha celular.
   • No caso de células teimosas, bater no recipiente pode acelerar o processo.
   • Observar as células cuidadosamente para evitar a sobre-exposição e potenciais danos.
4. Colheita de células
   • Quando as células estiverem completamente destacadas, deixe-as acumular-se no fundo do recipiente, colocando-o na vertical.
   • Adicionar o meio completo e, em seguida, dispersar e recolher as células pipetando sobre a camada de células.
   • Contar e proceder à subcultura.

Em ambos os métodos, é importante determinar as condições ideais para cada linha celular através de observação empírica. O processo deve preservar a viabilidade celular, que deve ser verificada regularmente para exceder 90% durante a subcultura. Estes procedimentos fornecem uma base para os investigadores se adaptarem com base nos requisitos e caraterísticas específicos das suas linhas celulares.

3.visão geral das técnicas de subcultura de células aderentes

A subcultura eficaz de células aderentes requer a sua separação do recipiente de cultura. São utilizados vários métodos, cada um adequado a diferentes tipos e condições de células. Ao selecionar um método de dissociação, é crucial ter em conta as necessidades específicas da linha celular e os objectivos da experiência. A monitorização regular da viabilidade celular, com um objetivo de mais de 90% no momento da subcultura, é essencial para a saúde e produtividade contínuas da cultura. Segue-se um resumo destes procedimentos: