Guia de Excelência em Cultura Celular da Cytion

Cytion fornece diretrizes abrangentes para a cultura de linhas celulares, enfatizando a importância da esterilidade e das técnicas assépticas. Nossos protocolos asseguram o sucesso dos esforços de cultura de células numa gama de tipos de células e aplicações.

1. Conceção do laboratório

A conceção de um laboratório de cultura de tecidos requer um planeamento cuidadoso para garantir a produção de material de alta qualidade num ambiente seguro e eficiente. As instalações ideais incluem áreas distintas para quarentena e processamento de materiais não contaminados, com incubadoras dedicadas a cada uma delas. Quando o espaço não permite a separação por áreas, aconselha-se a separação temporal do manuseamento de diferentes materiais. Protocolos de limpeza rigorosos e adesão a, pelo menos, níveis de contenção de Categoria 2 são essenciais para minimizar os riscos de contaminação e manter um ambiente laboratorial controlado.

2. Estabelecimento de um espaço de trabalho assético

• Práticas de campânula: Manter o fluxo de ar laminar posicionando corretamente a folha da hotte e evitando a desordem.
• Esterilização: Autoclavar instrumentos como pontas de pipetas e pipetas de vidro, e utilizar etanol a 70% para a descontaminação de superfícies.

3. Preparação de meios e reagentes

• Seleção de meios de cultura: Consulte as nossas tabelas de meios detalhadas para fazer corresponder a sua linha celular ao meio DMEM ou RPMI adequado, suplementado com aditivos como o Soro Fetal Bovino (FBS) e glutamina.
• Esterilidade dos suplementos: Todos os meios de cultura e suplementos devem ser estéreis, recorrendo à esterilização por filtração, se necessário.
• Equipamento de proteção individual: Nos laboratórios de cultura de células, a minimização dos danos depende do cumprimento rigoroso do equipamento de proteção individual, como luvas em conformidade com a norma EN374-3.
• Desinfeção: A minimização dos danos também depende da utilização correta de desinfectantes como o Hipoclorito de Sódio ou o Etanol. Para uma segurança e eficácia abrangentes na higiene laboratorial, a tabela seguinte apresenta desinfectantes adicionais e os seus casos de utilização específicos:

4. configuração do ambiente de cultura

• Frascos para linhas de células aderentes: Os frascos tratados com cultura de tecidos são geralmente adequados para a maioria das linhas celulares. Para certos tipos de células que requerem suporte adicional, os frascos podem ser pré-tratados ou revestidos com substratos como a gelatina ou a fibronectina. Estes revestimentos podem melhorar significativamente a fixação e a proliferação das células. Os protocolos detalhados para a preparação e revestimento podem ser encontrados nas respectivas fichas de informação do produto.
• Frascos para linhas de células em suspensão: Utilizar frascos especificamente concebidos para células não aderentes, que permitem a livre circulação e a troca de gases adequada. Estes frascos não requerem um tratamento de superfície que promova a fixação das células.

5. Monitorização da saúde das células

A manutenção da saúde das culturas de células é um aspeto crítico do trabalho com culturas de células. A monitorização contínua é essencial para garantir a integridade e a reprodutibilidade dos resultados experimentais. Seguem-se práticas pormenorizadas para monitorizar a saúde das células:

5.1. Controlos diários

• Avaliação microscópica: Inspecionar as células diariamente utilizando um microscópio para avaliar os principais indicadores da saúde das células, incluindo a fixação consistente das células, a morfologia caraterística e os padrões de crescimento esperados. Procurar uniformidade no tamanho e forma das células, a presença de núcleos distintos e a ausência de granularidade que possa indicar morte celular.
• Monitorização da taxa de crescimento: Mantenha-se a par da taxa de proliferação para garantir que está alinhada com o tempo de duplicação esperado para a linha celular. Alterações súbitas na taxa de crescimento podem sinalizar um problema subjacente com a saúde das células ou com as condições de cultura.
• Avaliação do meio: Verifique a cor do meio de cultura, que pode indicar alterações de pH. Um meio amarelado sugere um aumento da acidez, frequentemente um subproduto do metabolismo celular ou contaminação bacteriana, enquanto uma tonalidade púrpura ou cor-de-rosa pode indicar um ambiente mais básico.

5.2. Critérios para descartar culturas

• Indicadores de contaminação: Estar atento a sinais de contaminação, tais como turvação do meio, alterações inesperadas do pH ou a presença de colónias microbianas. As contaminações podem ser bacterianas, fúngicas ou virais, e cada tipo tem sinais visuais distintos, como películas bacterianas ou hifas fúngicas.
• Morfologia anormal: Se as células exibirem alterações anormais persistentes na morfologia não associadas ao crescimento ou diferenciação normais, pode ser necessário descartar a cultura. Isto inclui arredondamento extenso das células, descolamento ou a presença de detritos celulares.
• Sinais de stress irreversível: Procure indícios de stress irreversível ou toxicidade, tais como vacuolação, sangramento da membrana ou corpos apoptóticos. Estes são frequentemente precursores da morte celular e podem afetar os resultados experimentais.
• Degradação das condições de crescimento: Se a cultura tiver atingido a confluência ou o crescimento excessivo, levando à depleção de nutrientes e à acumulação de resíduos, a cultura deve ser subcultivada ou eliminada para evitar efeitos negativos na saúde das células.

6. Estratégias de subcultura

A subcultura, ou divisão de células, é uma parte rotineira da cultura de células que envolve a transferência de uma porção de uma cultura de células para um meio de crescimento fresco para propagar a cultura. Um planeamento e execução cuidadosos são fundamentais para o sucesso deste processo. Aqui estão algumas estratégias melhoradas para uma subcultura eficaz:

Planeamento de divisões

• Rácios de divisão ideais: Determine os rácios de divisão ideais com base nas caraterísticas da linha celular, nas taxas de crescimento e na utilização pretendida das culturas. Isto pode envolver uma divisão 1:2 para células de crescimento rápido ou uma divisão 1:10 para linhas de crescimento mais lento.
• Especificações do fornecedor: Consulte as fichas de produto do fornecedor para obter recomendações específicas para cada linha celular, que incluem frequentemente protocolos detalhados para subcultura e as condições que as células requerem.
• Continuidade da cultura: Mantenha um banco de células principal e utilize uma rotina de subcultura consistente para garantir a longevidade e a estabilidade genética da linha de células ao longo do tempo.

Divisão de células aderentes

Para um guia detalhado sobre a divisão de células aderentes, consulte o nosso artigo separado abaixo:

Dissociação da cultura de células ->

7.manutenção de meios

Reabastecimento atempado de nutrientes: Os meios devem ser mudados antes de as células esgotarem os nutrientes essenciais, o que é crucial para o seu crescimento e funções metabólicas.

controlo do pH e das toxinas: As mudanças regulares evitam a acumulação de subprodutos metabólicos e mantêm um pH fisiológico, essencial para a saúde das células.

8.controlo do número de passagens

Limitação de passagens: Manter um registo detalhado das passagens de células. A passagem frequente pode levar à deriva genética, que pode alterar o fenótipo e o comportamento das células. Ao limitar o número de passagens, está a manter a estabilidade genética e a integridade da linha celular.

Documentação do número de passagens: Sempre que as células forem subcultivadas, registe o número de passagem. Esta informação é essencial para acompanhar o historial da linha celular e identificar potenciais alterações relacionadas com a passagem no comportamento das células. Consulte o nosso guia abaixo para obter informações sobre como acompanhar com precisão os números de passagem.

Guia de número de passagem ->

9.garantir a integridade da linha celular

• Registos de verificação: Verificar regularmente a identidade da linha celular (por exemplo, através do perfil de repetições curtas em tandem (STR)) e anotar isto nos registos para garantir que a linha celular correta está a ser utilizada em todas as experiências.
• Monitorização de mutações: Se possível, monitorizar as principais alterações genéticas ou fenotípicas que possam indicar deriva genética ou contaminação da linha celular e manter estes registos para referência.