Publisert: 2023 | Sist oppdatert: mai 2026

Teknikker for dissociasjon av cellekulturer

Dissociasjon av cellekulturer er et avgjørende trinn i vedlikeholdet av cellekulturer. Det innebærer å løsne celler fra vekstoverflaten for å muliggjøre subkultivering eller høsting. Dette avsnittet beskriver to hovedmetoder: bruk av enzymfrie dissociasjonsbuffere og bruk av enzymatiske reagenser.

Bruk av enzymfrie dissosiasjonsbuffere

Denne metoden er skånsom og opprettholder cellenes integritet uten bruk av enzymer:

1. Forberedelse
   • Sørg for at alle reagenser er oppvarmet til 37 °C før bruk for å unngå sjokk for cellene.
2. Fjerning av vekstmedium:
   • Kast det gamle vekstmediet fra dyrkningsbeholderen.
3. Skylling
   • Skyll cellemonolagene med 5 ml kalsium- og magnesiumfritt PBS per T75-kolbe eller 100 mm-skål.
   • Rist beholderen forsiktig i 30 til 60 sekunder ved romtemperatur.
   • Sug opp og kast skyllevæsken.
   • Gjenta dette skylletrinnet én gang til.
4. Dissociasjon
   • Tilsett ca. 5 ml enzymfri celledissosiasjonsbuffer i beholderen.
   • Rist forsiktig ved romtemperatur i 1 til 2 minutter og sjekk for dissosiasjon under et mikroskop.
   • Bank kolben eller skålen mot hånden for å løsne cellene om nødvendig.
   • Hvis cellene sitter fast, la dem stå ved romtemperatur i ytterligere 2 til 5 minutter, og bank igjen om nødvendig, ved å bruke mer dissosiasjonsbuffer.
   • Når cellene har løsnet, tilsett minst 5 ml komplett vekstmedium for å nøytralisere dissosiasjonsbufferen og resuspendere cellene.
5. Kontroll av levedyktighet
   • Overvåk cellelevbarheten under subkultivering, og sørg for at den forblir over 90 %.

Bruk av andre reagenser for dissosiasjon

Denne metoden tillater bruk av ulike dissosiasjonsreagenser:

1. Fjerning av brukt medium
   • Kast det gamle mediet fra dyrkningsbeholderen.
2. Vasking av celler
   • Vask cellene med en balansert saltløsning uten kalsium og magnesium, eller bruk EDTA.
   • Tilsett vaskeløsningen forsiktig på siden motsatt cellene og vipp beholderen i 1 til 2 minutter før du kaster vaskeløsningen.
3. Dissociasjon
   • Påfør 2 til 3 ml av den valgte dissosiasjonsløsningen per 25 cm² vekstflate, og sørg for at cellearket dekkes.
   • Inkuber beholderen ved 37 °C og vipp forsiktig. Dissociasjon skjer vanligvis innen 5 til 15 minutter, avhengig av cellelinjen.
   • For vanskelige celler kan det hjelpe å banke lett på beholderen for å fremskynde prosessen.
   • Observer cellene nøye for å forhindre overeksponering og potensiell skade.
4. Høsting av celler
   • Når cellene er fullstendig løsnet, la dem samle seg på bunnen av beholderen ved å stille den oppreist.
   • Tilsett komplett medium, og spred og samle deretter cellene ved å pipettere over cellelaget.
   • Tell cellene og fortsett med subkultivering.

I begge metodene er det viktig å bestemme de optimale forholdene for hver cellelinje gjennom empirisk observasjon. Prosessen skal bevare cellenes levedyktighet, som rutinemessig bør kontrolleres for å sikre at den overstiger 90 % under subkultivering. Disse prosedyrene gir forskere et grunnlag for tilpasning basert på de spesifikke kravene og egenskapene til deres cellelinjer.

Oversikt over teknikker for subkultivering av vedheftende celler

Effektiv subkultivering av adherente celler krever at de løsnes fra dyrkningsbeholderen. Det benyttes ulike metoder, hver egnet for forskjellige celletyper og forhold. Når man velger en dissosiasjonsmetode, er det avgjørende å ta hensyn til cellelinjens spesifikke behov og eksperimentets mål. Regelmessig overvåking av cellelevbarhet, med et mål på over 90 % på tidspunktet for subkultivering, er avgjørende for kulturens fortsatte helse og produktivitet. Her er en oversikt over disse prosedyrene: