Teknikker for dissosiasjon av cellekulturer

Dissosiasjon av cellekulturer er et kritisk trinn i vedlikehold av cellekulturer. Det innebærer å løsne celler fra vekstoverflaten for å muliggjøre subkultur eller høsting. Dette avsnittet beskriver to hovedmetoder: bruk av enzymfrie dissosiasjonsbuffere og bruk av enzymatiske reagenser.

1.bruk av enzymfrie celledissosiasjonsbuffere

Denne metoden er skånsom og opprettholder cellenes integritet uten bruk av enzymer:

1. Forberedelse
   • Sørg for at alle reagenser er oppvarmet til 37 °C før bruk for å unngå sjokk for cellene.
2. Fjerning av vekstmedium
   • Kast det gamle vekstmediet fra dyrkningsbeholderen.
3. Skylling
   • Skyll cellemonolagene med 5 ml kalsium- og magnesiumfri PBS per T75-kolbe eller 100 mm skål.
   • Vugge beholderen forsiktig i 30 til 60 sekunder ved romtemperatur.
   • Aspirer og kast skyllevæsken.
   • Gjenta dette skylletrinnet én gang til.
4. Dissosiasjon
   • Tilsett ca. 5 ml enzymfri celledissosiasjonsbuffer i beholderen.
   • Vugge forsiktig i romtemperatur i 1 til 2 minutter, og kontroller dissosiasjonen under mikroskop.
   • Bank kolben eller skålen mot hånden for å løsne cellene hvis det er nødvendig.
   • Hvis cellene sitter fast, lar du dem stå i romtemperatur i ytterligere 2 til 5 minutter, og banker på dem igjen om nødvendig, med mer dissosiasjonsbuffer.
   • Når cellene er løsnet, tilsett minst 5 ml komplett vekstmedium for å nøytralisere dissosiasjonsbufferen og resuspendere cellene.
5. Kontroll av levedyktighet
   • Overvåk cellenes levedyktighet under subkulturering, og sørg for at den holder seg over 90 %.

2.bruk av andre reagenser for dissosiasjon

Denne metoden gjør det mulig å bruke ulike dissosiasjonsreagenser:

1. Fjerning av brukt medium
   • Kast det gamle mediet fra dyrkningsbeholderen.
2. Vasking av celler
   • Vask cellene med en balansert saltløsning uten kalsium og magnesium, eller bruk EDTA.
   • Tilsett vaskeløsningen forsiktig på motsatt side av cellene, og vipp beholderen i 1 til 2 minutter før vasken kastes.
3. Dissosiasjon
   • Påfør 2 til 3 ml av den valgte dissosiasjonsløsningen per 25 cm² av vekstoverflaten, og sørg for at hele celleskiktet dekkes.
   • Inkuber karet ved 37 °C, og vug forsiktig. Dissosiasjonen skjer vanligvis i løpet av 5 til 15 minutter, avhengig av cellelinjen.
   • Hvis cellene er gjenstridige, kan prosessen fremskyndes ved å banke på karet.
   • Observer cellene nøye for å unngå overeksponering og potensiell skade.
4. Høsting av celler
   • Når cellene er helt løsrevet, lar du dem samle seg i bunnen av beholderen ved å stille den oppreist.
   • Tilsett komplett medium, disperger og samle opp cellene ved å pipettere over cellelaget.
   • Tell og fortsett med subkulturering.

I begge metodene er det viktig å finne de optimale forholdene for hver cellelinje gjennom empirisk observasjon. Prosessen skal bevare cellenes levedyktighet, som rutinemessig bør kontrolleres slik at den overstiger 90 % under subkultiveringen. Disse prosedyrene gir forskerne et grunnlag som de kan tilpasse basert på de spesifikke kravene og egenskapene til cellelinjene sine.

3.oversikt over teknikker for subkulturering av adherente celler

Effektiv subkulturering av adherente celler krever at de løsnes fra dyrkingskaret. Det finnes ulike metoder som egner seg for ulike celletyper og forhold. Når man velger dissosiasjonsmetode, er det avgjørende å ta hensyn til cellelinjens spesifikke behov og målene med forsøket. Regelmessig overvåking av cellenes levedyktighet, med et mål om mer enn 90 % ved subkulturering, er avgjørende for at kulturen skal fortsette å være sunn og produktiv. Her er en oversikt over disse prosedyrene: