Publisert: 2023 | Sist oppdatert: mai 2026

Omfattende guide til frysing av celler: Sikre levedyktighet og sterilitet

Frysing av celler er en kritisk prosess i cellekulturhåndtering, som sikrer langvarig lagring og bevaring av verdifulle cellelinjer. Uansett om man arbeider med menneskelige eller dyreceller, er det avgjørende å følge nøyaktige protokoller og opprettholde strenge aseptiske teknikker for å oppnå vellykket kryokonservering.

Denne veiledningen gir detaljerte instruksjoner om nødvendige materialer, reagenser og trinnvise prosedyrer for å fryse celler effektivt samtidig som levedyktigheten og steriliteten bevares. Ved å følge disse retningslinjene kan forskere trygt lagre og senere gjenopplive cellekulturer med minimalt tap av cellelevedyktighet, og dermed opprettholde integriteten og påliteligheten til eksperimentresultatene.

For å begynne med er det viktig å etablere et sterilt arbeidsmiljø. Riktige aseptiske teknikker spiller en avgjørende rolle for å forhindre kontaminering og sikre kulturens sterilitet.

Aseptisk teknikk

Følg aseptiske teknikker gjennom hele prosessen for å sikre at kulturene forblir sterile.

Omfattende prosess for frysing av celler

Dette flytskjemaet gir en detaljert visuell veiledning til de viktigste trinnene i riktig frysing av celler. Følg disse prosedyrene for å sikre høy cellelevbarhet og integritet under kryokonserveringsprosessen.

Klargjøring av frysemedium

Forbered kryobeskyttende frysemedium i henhold til celletypen:

FBS-holdige kulturmedier: 90 % FBS + 10 % DMSO eller 70 % vekstmedium, 20 % FBS og 10 % DMSO
Celler som krever glyserol: 90 % FBS + 10 % glyserol

Vurder å anskaffe vårt ferdigblandede frysemedium:

Frysemedium CM-1: For protokoller som krever et medium som inneholder føtalt bovint serum (FBS)
Frysemedium CM-ACF – serumfritt: For et FBS-fritt alternativ

Merking og dokumentasjon

Merk kryorørene med følgende opplysninger:

Dato
Forskerens navn
Celle nummer
Passasjenummer
Celletype
Eventuell tilleggsinformasjon (f.eks. genetiske modifikasjoner)

Cellepreparat

For vedheftende celler:

Overvåk cellene til de når 85–95 % konfluens
Sug ut det gamle dyrkningsmediet
Skyll cellemonolaget med kalsium- og magnesiumfritt PBS
Løsne cellene med Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA og nøytraliser med dyrkningsmedium om nødvendig
Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml Falcon-rør

For suspensjonsceller:

Kontroller celletetthet og helse under et mikroskop
Overfør cellesuspensjonen direkte til et 50 ml Falcon-rør

Celltelling og sentrifugering

Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisk celleteller
Sentrifuger ved 300 g i 3–5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene
Sug forsiktig av supernatanten, uten å forstyrre cellepelleten
Varm det tilberedte frysemediet til 37 °C før bruk

Kryokonservering

Resuspender cellepelleten i frysemediet til en tetthet på 2,0 millioner celler/ml for vedheftende celler og 5 millioner celler/ml for suspensjonsceller, eller ønsket konsentrasjon
Fordel 1,0 ml (eller mer etter behov) av cellesuspensjonen i merkede kryorør
Bruk en langsom frysemetode før cellene overføres til langtidslagring

? Metode: ? Trinn
❄️ Manuell frysing: 1️⃣ Plasser cellene i frysemedium i en fryser ved 4 °C i 40 minutter.
2️⃣ Overfør til en fryser ved -80 °C i 24 timer.
3️⃣ Oppbevar cellene i flytende nitrogen for langvarig lagring.
? Bruk av Mr. Frosty: 1️⃣ Forbered cellene i kryorør med frysemedium.
2️⃣ Plasser kryorørene i Mr. Frosty-beholderen.
3️⃣ Oppbevar ved -80 °C i 24 timer før overføring til flytende nitrogen.
? Fryser med kontrollert hastighet: 1️⃣ Programmer enheten til å senke temperaturen gradvis.
2️⃣ Plasser de forberedte cellene i fryseren.
3️⃣ Etter frysesyklusen overfører du cellene til flytende nitrogen.

Oppbevar kryorørene ved temperaturer under -130 °C eller i flytende nitrogen for langvarig oppbevaring.

Materialer og reagenser

1–2 ml kryorør
CoolCell®-fryseenhet eller fryser med kontrollert hastighet
Kryobeskyttende frysemedium (f.eks. DIY-kryobeskyttelsesmedier, CM-1, CM-ACF eller spesialiserte medier)
Fosterkalveserum (FBS) eller kondisjonert medium
DMSO eller glyserol
Kalsium- og magnesiumfritt PBS
Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA (for vedheftende celler)
15 ml eller 50 ml Falcon-rør
Hemocytometer eller automatisk celleteller
Sentrifuge