Omfattende guide til nedfrysing av celler: Sikre levedyktighet og sterilitet

Nedfrysing av celler er en kritisk prosess i håndtering av cellekulturer, og sikrer langtidslagring og bevaring av verdifulle cellelinjer. Enten du arbeider med humane eller animalske celler, er det avgjørende å følge nøyaktige protokoller og opprettholde strenge aseptiske teknikker for å oppnå vellykket kryopreservering.

Denne veiledningen gir detaljerte instruksjoner om nødvendige materialer, reagenser og trinnvise prosedyrer for effektiv nedfrysing av celler, samtidig som cellenes levedyktighet og sterilitet bevares. Ved å følge disse retningslinjene kan forskere trygt oppbevare og senere gjenopplive cellekulturer med minimalt tap av cellers levedyktighet, og dermed opprettholde integriteten og påliteligheten til sine eksperimentelle resultater.

Først og fremst er det viktig å etablere et sterilt arbeidsmiljø. Riktig aseptisk teknikk spiller en avgjørende rolle når det gjelder å forhindre kontaminering og sikre at kulturene er sterile.

Aseptisk teknikk

Følg aseptisk teknikk gjennom hele prosessen for å sikre at kulturene er sterile.

Omfattende prosess for frysing av celler

Dette flytskjemaet gir en detaljert visuell veiledning til de viktigste trinnene som er involvert i riktig nedfrysing av celler. Følg disse prosedyrene for å sikre høy cellelevedyktighet og -integritet under kryopreserveringsprosessen.

Forberedelse av frysemedium

Tilbered kryobeskyttende frysemedium i henhold til celletypen:

FBS-holdige mediekulturer: 90 % FBS + 10 % DMSO eller 70 % vekstmedium, 20 % FBS og 10 % DMSO
Celler som krever glyserol: 90 % FBS + 10 % glyserol

Vurder å anskaffe vårt ferdigformulerte frysemedium:

FrysemediumCM-1: For protokoller som krever et medium som inneholder føtalt bovint serum (FBS)
Frysemedium CM-ACF - serumfritt: For et FBS-fritt alternativ

Merking og dokumentasjon

Merk kryovialene med følgende opplysninger:

Dato
Forskerens navn
Cellenummer
Passasjenummer
Celletype
Eventuell tilleggsinformasjon (f.eks. genetiske modifikasjoner)

Forberedelse av celler

For adherente celler:

Overvåk cellene til de når 85-95 % konfluens
Aspirer det gamle dyrkningsmediet
Skyll cellelaget med kalsium- og magnesiumfri PBS
Løsne cellene med Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA, og nøytraliser med dyrkingsmedium om nødvendig
Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml Falcon-rør

For suspensjonsceller:

Kontroller celletettheten og celletilstanden under mikroskop
Overfør cellesuspensjonen direkte til et 50 ml Falcon-rør

Celletelling og sentrifugering

Tell cellene med et hemocytometer eller en automatisert celleteller
Sentrifuger ved 300 g i 3-5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene
Aspirer supernatanten forsiktig, og unngå å forstyrre cellepelleten
Varm det tilberedte frysemediet til 37 °C før bruk

Kryopreservering

Resuspender cellepelleten i frysemediet til en tetthet på 2,0 millioner celler/ml for adherente celler og 5 millioner celler/ml for suspensjonsceller, eller ønsket konsentrasjon
Alikvotér 1,0 ml (eller mer etter behov) av cellesuspensjonen til merkede kryovialer
Bruk en langsom nedfrysingsmetode før du overfører cellene til langtidslagring

? Metode	? Trinn
❄️ Manuell nedfrysing	1️⃣ Plasser celler i frysemedium i en fryser på 4 °C i 40 minutter. 2️⃣ Overfør til en fryser på -80 °C i 24 timer. 3️⃣ Oppbevar celler i flytende nitrogen for langtidsoppbevaring
? Bruk av Mr. Frosty	1️⃣ Klargjør celler i kryovialer med frysemedium. 2️⃣ Plasser kryovialene i Mr. Frosty-beholderen. 3️⃣ Oppbevares ved -80 °C i 24 timer før de overføres til flytende nitrogen
? Fryser med kontrollert hastighet	1️⃣ Programmer enheten til gradvis å senke temperaturen. 2️⃣ Plasser de klargjorte cellene i fryseren. 3️⃣ Overfør cellene til flytende nitrogen etter frysesyklusen

Oppbevar kryovialene ved temperaturer under -130 °C eller i flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.

Materialer og reagenser

1-2 ml kryovialer
CoolCell®-fryseenhet eller fryser med kontrollert hastighet
Kryobeskyttende frysemedium (f.eks. DIY-kryobeskyttende medier, CM-1, CM-ACF eller spesialmedier)
Føtalt bovint serum (FBS) eller kondisjonerte medier
DMSO eller glyserol
Kalsium- og magnesiumfri PBS
Accutase, Trypsin eller Trypsin-EDTA (for adherente celler)
15 ml eller 50 ml Falcon-rør
Hemocytometer eller automatisk celleteller
Sentrifuge