Žinduolių ląstelių kultūra: Pagrindai ir metodai
Žinduolių ląstelių kultūros yra vienas iš pagrindinių biologinių tyrimų metodų, leidžiančių mokslininkams tirti ląsteles kontroliuojamoje aplinkoje už gyvų organizmų ribų. Šis procesas apima ląstelių išskyrimą iš audinių, jų palaikymą kruopščiai kontroliuojamomis sąlygomis ir dauginimą įvairiais eksperimentiniais tikslais. Žinduolių ląstelių kultūros yra labai svarbios norint suprasti ląstelių procesus, ligų mechanizmus ir kurti naujus gydymo būdus, įskaitant tuos, kuriems naudojamos nemirtingos ląstelių linijos
Pagrindinės išvados:
- Ląstelės gali būti išskiriamos iš audinių taikant fermentinio skaidymo arba eksplantų kultūros metodus
- Pirminių ląstelių gyvavimo trukmė ribota, o nemortizuotų ląstelių linijos gali daugintis neribotą laiką
- Kultivavimo sąlygos, įskaitant auginimo terpės sudėtį, yra labai svarbios ląstelių išlikimui ir dauginimuisi
- Ląstelės gali būti auginamos suspensijos arba adherentinėse kultūrose, priklausomai nuo jų tipo ir tyrimų poreikių
- Dažniausiai naudojamos šios terpės: MEM, DMEM ir RPMI 1640, pritaikytos tam tikriems ląstelių tipams
- Įprastos augimo sąlygos: 37 °C temperatūra, 5 % CO2 ir 95 % santykinė oro drėgmė
- Siekiant išvengti galimo užterštumo, vis dažniau naudojamos serumo alternatyvos, pavyzdžiui, žmogaus trombocitų lizatas (hPL)
Ląstelių išskyrimo metodai
Ląstelių kultūros kūrimo procesas prasideda nuo ląstelių išskyrimo iš audinių. Tam yra keletas metodų, kurių kiekvienas tinka skirtingiems audinių tipams ir tyrimų tikslams. Kraujo mėginių atveju ląstelių išskyrimas yra gana paprastas, o dėl jų augimo galimybių daugiausia dėmesio skiriama baltosioms kraujo ląstelėms. Kietiesiems audiniams reikia sudėtingesnių išskyrimo metodų. Vienas iš įprastų metodų yra fermentinis skaidymas, kai naudojami tokie fermentai kaip kolagenazė, tripsinas ar pronazė, kurie suardo ekstraląstelinį matricą ir išlaisvina atskiras ląsteles į suspensiją. Taip pat mokslininkai gali taikyti eksplantų auginimo metodą, kai maži audinio gabalėliai dedami tiesiai į augimo terpę, kad ląstelės galėtų migruoti ir daugintis. Šių metodų pasirinkimas dažnai priklauso nuo konkretaus audinio tipo, pageidaujamos ląstelių populiacijos ir numatomo eksperimentinio naudojimo. Svarbu pažymėti, kad tiesiogiai iš organizmo išskirtos ląstelės vadinamos pirminėmis ląstelėmis ir, išskyrus kai kurias išimtis, pavyzdžiui, iš navikų gautas ląsteles, paprastai kultūroje gyvena ribotą laiką, kol pradeda senti
Svarbiausi produktai žinduolių ląstelių kultūroms
| Produkto pavadinimas | Produkto numeris | Kategorija | Taikymas |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/l gliukozės, w: 4 mM L-glutamino, w: 1,5 g/l NaHCO3, w: 1,0 mM natrio piruvato | 820300a | Kultūrų terpės | Bendros paskirties terpė įvairių tipų žinduolių ląstelėms |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/l gliukozės, w: 1,6 mM L-gliutamino, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM natrio piruvato, w: 1,2 g/l NaHCO3 | 820400a | Kultūrų terpės | Tinka įvairioms žinduolių ląstelėms, ypač epitelio ląstelėms |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabilaus glutamino, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kultūrų terpė | Dažniausiai naudojama limfoidinėms ląstelėms ir hibridinėms ląstelių linijoms |
| Accutase | 830100 | Ląstelių disociacija | Švelnus ląstelės atskyrimo tirpalas, skirtas adherentiškoms ląstelėms |
| Užšaldymo terpė CM-1 | 800150 | Kriokonservavimas | Žinduolių ląstelėms užšaldyti ir ilgalaikiam saugojimui |
| Užšaldymo terpė CM-ACF, be serumo | 800650 | Kriokonservavimas | Ląstelių šaldymo terpė be gyvūninės kilmės komponentų |
| PBS | 860015 | Buferinis tirpalas | Skirtas ląstelėms plauti ir pH pusiausvyrai palaikyti |
| Endotelio ląstelių augimo terpė | 820731 | Specializuotos terpės | Optimizuota endotelio ląstelėms auginti |
| Mikoplazmų tyrimas | 900159 | Kokybės kontrolė | Svarbi siekiant nustatyti mikoplazmų užterštumą kultūrose |
| Ląstelių linijos autentiškumo nustatymas - Žmogus | 900154 | Kokybės kontrolė | Tikrina žmogaus ląstelių linijų tapatybę |
Šioje lentelėje pateikiami atrinkti svarbiausi žinduolių ląstelių kultūroms skirti produktai. Visą ląstelių kultūrų produktų asortimentą, įskaitant specializuotas terpes ir reagentus, rasite mūsų terpių ir reagentų kategorijos puslapyje.
- švelni alternatyva tripsinui
"Accutase"
- tai ląstelių atskyrimo tirpalas, kuris iš esmės keičia ląstelių kultūrų pramonę. Tai proteolitinių ir kolagenolitinių fermentų mišinys, imituojantis tripsino ir kolagenazės veikimą. Skirtingai nei tripsino, "Accutase" sudėtyje nėra jokių žinduolių ar bakterijų komponentų ir yra daug švelnesnis ląstelėms, todėl yra idealus sprendimas įprastam ląstelių atskyrimui nuo standartinių audinių kultūrų plastikinių indų ir adhezija padengtų plastikinių indų. Šiame tinklaraščio įraše nagrinėsime "Accutase" privalumus ir panaudojimo būdus bei tai, kaip ji keičia ląstelių kultūrų kultūrų naudojimo principus.
"Accutase" privalumai
Accutase turi keletą privalumų, palyginti su tradiciniais tripsino tirpalais. Pirma, ji gali būti naudojama, kai reikia švelniai ir efektyviai atskirti bet kokią adhezyvinę ląstelių liniją, todėl ja galima tiesiogiai pakeisti tripsiną. Antra, "Accutase" labai gerai veikia embrionines ir neuronines kamienines ląsteles, be to, įrodyta, kad ji išlaiko šių ląstelių gyvybingumą ir po pasaugojimo. Trečia, "Accutase" išsaugo daugumą epitopų vėlesnei srauto citometrijos analizei, todėl ji idealiai tinka ląstelių paviršiaus žymenų analizei.
Be to, "Accutase" nereikia neutralizuoti perkeliant adherentines ląsteles. Po to, kai ląstelės padalijamos, įpilus daugiau terpės, Accutase praskiedžiama, todėl ji nebegali atskirti ląstelių. Dėl to nereikia atlikti inaktyvavimo etapo, o ląstelių kultūrų specialistai sutaupo laiko. Galiausiai "Accutase" nereikia alikvotuoti, o buteliukas šaldytuve išlieka stabilus 2 mėnesius.
Accutase" taikymas
Accutase tiesiogiai pakeičia tripsino tirpalą ir gali būti naudojama ląstelių linijų pasažavimui. Be to, "Accutase" gerai veikia atskyrus ląsteles daugelio ląstelių paviršiaus žymenų analizei naudojant srauto citometriją ir ląstelių rūšiavimui. Kiti tolesni "Accutase" apdorojimo būdai: ląstelių paviršiaus žymenų analizė, virusų augimo tyrimas, ląstelių proliferacijos, navikinių ląstelių migracijos tyrimai, įprastinis ląstelių perėjimas, gamybos didinimas (bioreaktorius) ir srauto citometrija.
Accutase sudėtis
Accutase sudėtyje nėra žinduolių ar bakterijų komponentų, tai natūralus fermentų mišinys, pasižymintis proteolitiniu ir kolagenolitiniu fermentų aktyvumu. Jo sudėtis yra daug mažesnės koncentracijos nei tripsino ir kolagenazės, todėl jis yra mažiau toksiškas ir švelnesnis, bet toks pat veiksmingas.
Accutase veiksmingumas
Įrodyta, kad "Accutase" veiksmingai atskiria pirmines ir kamienines ląsteles ir išlaiko didelį ląstelių gyvybingumą, palyginti su gyvūninės kilmės fermentais, tokiais kaip tripsinas. 100 % ląstelių atgaunama po 10 minučių, o dėl savaiminio "Accutase" virškinimo "Accutase" nekenkia palikti ląsteles "Accutase" iki 45 minučių.
Apibendrinant
Apibendrinant galima teigti, kad "Accutase" yra galingas sprendimas, kuris keičia ląstelių kultūrų žaidimo taisykles. Dėl savo švelnumo, veiksmingumo ir universalumo "Accutase" yra ideali tripsino alternatyva. Jei ieškote patikimo ir veiksmingo ląstelių atskyrimo sprendimo, "Accutase" yra jums tinkamas sprendimas.
Fosfatu buferizuotas fiziologinis tirpalas (PBS) yra plačiai naudojamas buferinis tirpalas biologiniuose ir cheminiuose tyrimuose. Jis atlieka svarbų vaidmenį palaikant pH pusiausvyrą ir osmoliariškumą atliekant įvairias eksperimentines procedūras, įskaitant audinių apdorojimą ir ląstelių auginimą. Mūsų PBS tirpalas yra kruopščiai sukurtas iš didelio grynumo ingredientų, kad būtų užtikrintas kiekvieno eksperimento stabilumas ir patikimumas. Mūsų PBS tirpalo osmoliariškumas ir jonų koncentracija tiksliai atitinka žmogaus organizmo osmoliariškumą ir jonų koncentraciją, todėl jis yra izotoninis ir netoksiškas daugumai ląstelių.
Mūsų PBS tirpalo sudėtis
Mūsų PBS tirpalas yra pH sureguliuotas itin grynų fosfatinių buferių ir fiziologinių tirpalų mišinys. 1X darbinės koncentracijos tirpale yra:
8000 mg/l natrio chlorido (NaCl)
200 mg/l kalio chlorido (KCl)
1150 mg/l natrio fosfato dibazinio bevandenio (Na2HPO4)
200 mg/L Kalio fosfatas vienbazis bevandenis (KH2PO4)
Ši sudėtis užtikrina optimalią pH ir jonų pusiausvyrą, tinkančią įvairioms biologinėms reikmėms.
Mūsų PBS tirpalo taikymas
Mūsų PBS tirpalas idealiai tinka įvairioms biologinių tyrimų reikmėms. Dėl izotoninių ir netoksiškų savybių jis tinka medžiagoms skiesti ir ląstelių talpykloms skalauti. PBS tirpalai, kurių sudėtyje yra EDTA, efektyviai išlaisvina prisitvirtinusias ir susitelkusias ląsteles. Tačiau į PBS negalima dėti dvivalenčių metalų, pavyzdžiui, cinko, nes tai gali sukelti nuosėdų susidarymą. Tokiais atvejais rekomenduojama naudoti Good's buferius. Be to, mūsų PBS tirpalas yra priimtina alternatyva virusų transportavimo terpei RNR virusams, įskaitant SARS-CoV-2, transportuoti ir laikyti.
Kokybės kontrolė
Steriliai filtruotas
Laikymas ir galiojimo laikas
Laikyti nuo +2 °C iki +25 °C temperatūroje, saugoti nuo šviesos.
Atidarytą laikykite nuo 2 °C iki 25 °C temperatūroje ir sunaudokite per 24 mėnesius.
Gabenimo sąlygos
Aplinkos temperatūra
Priežiūra
Laikyti šaldytuve nuo +2°C iki +8°C temperatūroje, tamsioje vietoje. Venkite užšaldymo ir dažno pašildymo iki +37°C, nes tai pablogina produkto kokybę.
Nešildykite terpės aukštesnėje nei 37°C temperatūroje ir nenaudokite nekontroliuojamų šilumos šaltinių, pavyzdžiui, mikrobangų krosnelių.
Jei reikia naudoti tik dalį terpės, prieš naudojimą paimkite reikiamą kiekį ir pašildykite iki kambario temperatūros.
Sudėtis
Kategorija
Sudedamosios dalys
Koncentracija (mg/l)
Druskos
Kalio chloridas
200
Kalio fosfatas monobazinis bevandenis
200
Natrio chloridas
8000
Natrio fosfatas dvibazis bevandenis
1150
Analizės metodas
CLS siūlo tiek trumpalaikius, tiek ilgalaikius mikoplazmos nustatymo tyrimus. Pirmuoju atveju mėginiai tiriami iš karto po atvežimo, o antruoju atveju pradedama ląstelių kultūra ir ląstelės tiriamos po 14 dienų auginimo be antibiotikų. Mikoplazmos tyrimai atliekami naudojant dviejų taškų aptikimo sistemą, naudojant "PlasmoTest™"
- Mycoplasma Detection Kit ("Invivogen") ir "Certus QC
- mycoADVANCED" aptikimo rinkinį ("Certus").
Mėginiai
Greitajam tyrimui atlikti pateikite ne mažiau kaip 50 µl ląstelių suspensijos, kurioje yra 50 000 ląstelių. Ląstelių suspensija gali būti siunčiama aplinkos temperatūroje.
Aukščiausios kokybės tyrimui pateikite mažiausiai 1 milijoną ląstelių tinkamoje užšaldymo terpėje, kad būtų užtikrinta tvirta ir sveika kultūra ląstelių auginimui ir vėlesniam tyrimui. Mėginius siųskite su sausu ledu.
Užpildykite Mikoplazmos tyrimo mėginio formą ir pridėkite ją prie mėginio siuntos.
Kolorimetrinis reporterio tyrimas
Šis tyrimas yra ląstelių kolorimetrinis tyrimas. Esant mikoplazmai, reporterio ląstelių linija indukuoja signalinę kaskadą, sukeliančią terpės spalvos pasikeitimą iš raudonos į mėlyną. Tyrimas atliekamas 96 duobučių daugiabriaunėse plokštelėse. Signalai aptinkami mikroplokštelių spektrofotometru, kai bangos ilgis 620-655 nm. Aptinkamos visos mikoplazmos ir acholeplazmos rūšys, taip pat kiti ląstelių kultūrų teršalai, pavyzdžiui, bakterijos.
Izoterminis stiprinimas
Izoterminis amplifikavimas yra greitas ir patikimas tyrimas, pagrįstas izoterminiu mikoplazmai būdingos DNR amplifikavimu ir aptikimu realiuoju laiku naudojant DNR interkaluojantį dažiklį. Tyrimu galima aptikti šešias labiausiai paplitusias rūšis, kurios sudaro > 95 % užterštumo atvejų: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis ir A.laidlawii. Dėl sekų homologijos aptinkamos ir kitos mikoplazmų rūšys (M.pneumoniae, M.gallisepticum ir M.synoviae). Norint nustatyti, ar mėginys yra teigiamas, ar neigiamas mikoplazmos atžvilgiu, tiriama lydymosi temperatūra (Tm).
Išvados: Svarbiausias žinduolių ląstelių kultūrų vaidmuo šiuolaikiniuose moksliniuose tyrimuose
Žinduolių ląstelių kultūros sukėlė revoliuciją biologiniuose ir medicininiuose tyrimuose, suteikdamos mokslininkams galingų priemonių sudėtingiems ląsteliniams procesams, ligų mechanizmams ir galimoms terapinėms intervencijoms tirti. Nuo pirminių ląstelių išskyrimo iki nemoralizuotų ląstelių linijų kūrimo - šis metodas tapo nepakeičiama šiuolaikinio mokslo priemonių rinkinio dalimi
Žinduolių ląstelių kultūros kelias prasideda nuo kruopštaus išskyrimo metodų, tęsiasi nuo kruopštaus ląstelių palaikymo specializuotose terpėse ir baigiasi plačiu pritaikymo spektru įvairiose mokslo srityse. Nesvarbu, ar tai būtų vėžio tyrimai, vaistų atradimas, ar pagrindinė ląstelių biologija, galimybė auginti žinduolių ląsteles in vitro ir jomis manipuliuoti atvėrė neregėtas galimybes moksliniams tyrimams
Žinduolių ląstelių kultūrų sėkmės raktas yra kruopščiai kontroliuojamos sąlygos, kuriomis ląstelės palaikomos. Kiekvienas aspektas - nuo auginimo terpės sudėties iki tikslių aplinkos parametrų inkubatoriuose - optimizuojamas taip, kad kuo geriau atitiktų natūralias ląstelių sąlygas. Toks dėmesys detalėms užtikrina eksperimentų patikimumą ir atkuriamumą, o tai yra geros mokslinės praktikos pagrindas
Imortalizuotų ląstelių linijų, tokių kaip plačiai naudojamos HeLa ląstelės, sukūrimas dar labiau išplėtė ląstelių kultūros galimybes. Šios ląstelių linijos suteikia nuoseklius, lengvai prieinamus ląstelių modelius, kurie paspartino daugelio sričių mokslinius tyrimus
Žvelgdami į ateitį, žinduolių ląstelių kultūros toliau vystosi. 3D kultūrų metodų, organoidų kūrimo ir chemiškai apibrėžtų terpių naudojimo pažanga plečia ląstelių kultūrų galimybių ribas. Šie pokyčiai žada, kad in vitro modeliai dar labiau priartės prie sudėtingų in vivo sistemų, o tai gali sukelti revoliuciją vaistų atradimo, individualizuotos medicinos ir mūsų supratimo apie žmogaus biologiją srityse
Apibendrinant galima teigti, kad žinduolių ląstelių kultūros išlieka dinamiškas ir labai svarbus gyvybės mokslų tyrimų metodas. Jos nuolatinis tobulinimas ir taikymas neabejotinai atliks lemiamą vaidmenį sprendžiant kai kuriuos aktualiausius biologijos ir medicinos klausimus ir skatins mokslo pažangą dar daugelį metų