Vaistų derinių atranka naudojant SK kiaušidžių vėžio modelius

Kiaušidžių vėžys tebėra vienas iš mirtiniausių ginekologinių piktybinių navikų, o dauguma pacienčių ilgainiui įgyja atsparumą standartinei chemoterapijai platinos pagrindu. Bendrovėje "Cytion" suprantame, kad šiam terapiniam iššūkiui įveikti reikia sistemingai tirti vaistų derinius, kurie gali padidinti veiksmingumą, įveikti atsparumo mechanizmus ir sumažinti toksiškumą. SK kiaušidžių vėžio ląstelių linijos, ypač SK-OV-3, tapo nepakeičiamais įrankiais didelės apimties vaistų derinių atrankai, leidžiančiais mokslininkams nustatyti sinergetinius režimus, kurie yra perspektyvūs klinikiniam taikymui.

Pagrindinės išvados

• SK-OV-3 ląstelės pasižymi atsparumu platinai, todėl idealiai tinka kombinuotai terapijai atrasti
• Matricomis pagrįsti atrankinės patikros metodai leidžia sistemingai vertinti vaistų poras
• Sinergijos kiekybinio įvertinimo metodai, įskaitant Bliss, Loewe ir Chou-Talalay, padeda atrinkti hitus
• Mechanistiniai tyrimai atskleidžia sinergetinės sąveikos molekulinį pagrindą
• 3D sferoidiniai modeliai padidina in vivo derinių veiksmingumo prognozavimo tikslumą

SK-OV-3: pagrindinis platinai atsparaus kiaušidžių vėžio modelis

SK-OV-3 ląstelės buvo gautos iš kiaušidžių adenokarcinoma sergančios pacientės ascitinio skysčio ir tapo viena išsamiausiai apibūdintų kiaušidžių vėžio ląstelių linijų. Dėl joms būdingo atsparumo chemoterapijai platinos pagrindu jos ypač vertingos nustatant derinių strategijas, galinčias įveikti šį kliniškai reikšmingą atsparumo fenotipą.

Mūsų SK-OV-3 ląstelės (300342 ) turi keletą molekulinių savybių, kurios lemia jų atsparumo vaistams fenotipą. Tarp jų yra p53 nulinis statusas, panaikinantis kritinį atsako į DNR pažeidimus kelią, HER2 amplifikacija, skatinanti išgyvenamumą skatinančius signalus, ir konstitucinis PI3K/AKT kelio aktyvinimas, skatinantis ląstelių išgyvenamumą po citotoksinio poveikio.

SK-OV-3 ląstelių epitelio-mezenchiminio virsmo (EMT) savybės dar labiau padidina jų svarbą vaistų derinių atrankai. EMT yra susijęs su chemorezistentiškumu įvairių tipų vėžio atveju, o junginiai, galintys pakeisti EMT arba užkirsti jai kelią, gali sąveikauti su įprastiniais citotoksiniais preparatais.

Matricomis pagrįsti derinių atrankos metodai

Sistemingai vaistų derinių atrankai reikia struktūrizuotų metodų, kurie veiksmingai atrinktų derinių erdvę. Matricos modeliai, kai du vaistai derinami per koncentracijų tinklelį, leidžia išsamiai apibūdinti vaistų sąveiką įvairiais dozių santykiais ir poveikio lygiais.

Tipiška 6×6 arba 8×8 dozių ir atsako matrica tiria kiekvieną vaistą keliomis koncentracijomis atskirai ir visais poriniais deriniais. Tokia konstrukcija leidžia gauti pakankamai duomenų, kad būtų galima griežtai kiekybiškai įvertinti sinergiją, ir tuo pat metu išlieka suderinama su 384 duobučių plokštelių formatais, kuriuos galima automatizuoti. SK-OV-3 ląstelės gerai prisitaiko prie didelio tankio plokštelių formatų, išlaikydamos pastovų augimą ir atsaką į vaistus.

Eksperimento planas turėtų apimti atitinkamas kontrolės priemones: neapdorotos ląstelės, kiekvieno vaisto kontrolinė medžiaga ir vieno vaisto dozės ir atsako kreivės. Duobutės su pakartojimais (paprastai n=3-4 kiekvienai sąlygai) leidžia statistiškai įvertinti sinergijos reikšmingumą. Citotoksinių medžiagų derinių gydymo trukmė yra 72 valandos, nors tikslinių medžiagų deriniams gali būti tinkamas trumpesnis laikas.

Sinergijos kiekybinis įvertinimas ir duomenų analizė

Egzistuoja daugybė matematinių sistemų, skirtų kiekybiniam vaistų sąveikos įvertinimui, kurių kiekviena turi skirtingas prielaidas ir interpretacijas. Chou-Talalay derinio indekso (CI) metodas, pagrįstas medianos ir poveikio lygtimi, tebėra plačiai naudojamas: CI reikšmės, mažesnės nei 1, rodo sinergiją, lygios 1 - adityvumą, o didesnės nei 1 - antagonizmą.

Pagal Bliss nepriklausomumo modelį daroma prielaida, kad vaistai veikia nepriklausomais mechanizmais, o tikėtinas derinio poveikis apskaičiuojamas kaip atskirų vaistų poveikio sandauga. Teigiamos Excess over Bliss (EOB) reikšmės rodo sinergiją. Pagal Loewe priklausomybės modelį daroma prielaida, kad vaistai yra funkciškai lygiaverčiai, o sąveikai vizualizuoti naudojamos izobologramos.

Šiuolaikinės analitinės priemonės, įskaitant "SynergyFinder" ir "Combenefit", automatizuoja sinergijos skaičiavimus pagal kelis modelius ir generuoja paviršiaus diagramas, kuriose vizualizuojami sinergijos kraštovaizdžiai visoje dozės ir atsako matricoje. Šios priemonės padeda nustatyti optimalius dozių santykius, rodančius didžiausią sinergiją.

Atrankos kampanijų atveju Z-score arba ZIP (nulinio sąveikos potencialo) rodikliai leidžia palyginti visas junginių poras ir nustatyti perspektyviausius derinius tolesniam patvirtinimui.

Sinerginių derinių mechanistinis tyrimas

Sinergetinių derinių nustatymas yra tik pirmas žingsnis; norint juos pritaikyti klinikinėje praktikoje, labai svarbu suprasti molekulinius mechanizmus, kurie lemia sinergiją. SK-OV-3 ląstelės yra tinkamos įvairiems molekuliniams tyrimams, kurie gali padėti išsiaiškinti sinergijos mechanizmus.

Ląstelių ciklo analizė srauto citometrijos metodu atskleidžia, ar deriniai sustiprina ląstelių ciklo sulaikymą, palyginti su atskirais preparatais. Apoptozės tyrimai, įskaitant Annexin V dažymą, kaspazių aktyvavimo matavimus ir PARP skilimo vakarietiškus blotus, nustato, ar sinergija pasireiškia padidėjusia ląstelių mirtimi.

Specifinių kelių analizės tiria vaistų derinių signalų poveikį. Pavyzdžiui, derinius, nukreiptus į PI3K/AKT kelią, galima įvertinti naudojant fosforobaltymų vakarų blotus arba daugkartinio ELISA tyrimo grupes, matuojančias kelio mazgų fosforilinimą. Kombinuotais vaistais apdorotų ląstelių RNR sekos nustatymas atskleidžia transkripcijos programas, prisidedančias prie sinergetinio poveikio.

3D sferoidų modeliai geresniam prognozavimui

Dvimatės viensluoksnės kultūros netinkamai atspindi sudėtingą naviko mikroaplinką, kurioje turi veikti vaistų deriniai. SK-OV-3 sferoiduose, auginamuose itin mažo prisitvirtinimo sąlygomis arba įterptuose į ekstraląstelinį matricą, susidaro vaistų skvarbos gradientai ir hipoksiniai branduoliai, kurie daro įtaką derinių veiksmingumui.

Sferoidų pagrindu atliekama derinių atranka dažnai atskleidžia skirtingus sinergijos modelius, palyginti su 2D kultūra, nes vaistų skverbtis tampa lemiamu veiksniu. Deriniai, kuriuose viena medžiaga sustiprina kitos medžiagos skvarbą į naviką, gali pasižymėti geresne sinergija 3D formatuose.

SK-OV-3 sferoidų didelio turinio vaizdavimas leidžia įvertinti derinio poveikį sferoidų dydžiui, morfologijai ir gyvybingumo gradientams. Išvalyti sferoidai gali būti analizuojami dėl erdvinių atsako į vaistą modelių, nustatant, ar sinergija pasireiškia konkrečiose naviko srityse.

Rekomenduojami produktai, skirti kiaušidžių vėžio derinių atrankai:

• SK-OV-3 ląstelės (300342) - platinai atsparaus kiaušidžių vėžio modelis
• DMEM su dideliu gliukozės kiekiu (820300a) - optimali terpė
• Užšaldymo terpė CM-ACF (800650) - Kriokonservavimo tirpalas