Nevirusinės genų pristatymo sistemos susilaukė didelio mokslininkų bendruomenės dėmesio dėl savo geresnių saugos charakteristikų, palyginti su virusiniais vektoriais. Dirbdami su tokiomis ląstelių linijomis kaip HeLa ir HEK293 ląstelės, mokslininkai pastebėjo mažesnį imunogeninį atsaką ir mažesnį citotoksiškumą.

Pagrindiniai saugos privalumai yra šie:

• Minimali įterptinės mutagenezės rizika
• Mažesnis tikslinių ląstelių imunogeniškumas
• Mažesnė endogeninės viruso rekombinacijos galimybė
• Geresnė pristatymo naudingojo krūvio dydžio kontrolė

Naujausi tyrimai, atlikti naudojant HEK293T ląsteles, parodė, kad nevirusiniais pristatymo metodais galima pasiekti didelį transfekcijos efektyvumą, išlaikant didesnį nei 90 % ląstelių gyvybingumą. Tai yra reikšmingas patobulinimas, palyginti su ankstesnės kartos nevirusiniais vektoriais, ir priartina jų efektyvumą prie virusinių sistemų, tačiau užtikrina geresnius saugos parametrus.

Lipidų nanodalelės (LNP) ir polimerų pagrindu sukurtos pristatymo sistemos yra nevirusinės genų pristatymo technologijos viršūnė. Atlikus tyrimus su MCF-7 ir HepG2 ląstelėmis, paaiškėjo, kad šios sistemos yra nepaprastai universalios ir veiksmingos pernešant įvairius genetinius krovinius.

Dabartinės pristatymo sistemų naujovės yra šios:

• pH jautrūs lipidų preparatai, užtikrinantys geresnį endosominį išsiskyrimą
• Biologiškai skaidūs polimerai su tikslingais atpalaidavimo mechanizmais
• Hibridinės sistemos, kuriose derinami lipidų ir polimerų komponentai
• Paviršiumi modifikuotos nanodalelės, užtikrinančios geresnį nukreipimą į ląsteles

Ypač daug vilčių teikiančių rezultatų pasiekta A549 ląstelėse, kuriose naujos kartos LNP pasiekė transfekcijos rodiklius, prilygstančius virusiniams vektoriams. Šiomis sistemomis puikiai pernešami įvairūs kroviniai - nuo mažos trikdančios RNR iki didesnės plazmidinės DNR, išlaikant aukštą ląstelių gyvybingumą ir raiškos lygį.

Naujausi polimerų pagrindu sukurtų sistemų pasiekimai, išbandyti U2OS ląstelėse, parodė geresnes branduolinio nukreipimo galimybes ir mažesnį citotoksiškumą, o tai reiškia didelę pažangą įveikiant tradicines nevirusinio pristatymo kliūtis.

Fiziniai genų pristatymo metodai, ypač elektroporacija, tapo galinga cheminių metodų alternatyva. Šie metodai itin perspektyvūs sunkiai transfektuojamose ląstelių linijose, pavyzdžiui, THP-1 ląstelėse, ir pirminėse ląstelių kultūrose, kur tradiciniai metodai dažnai nepasiteisina.

Šiuolaikiniai fizikiniai perdavimo metodai yra šie:

• Pažangūs elektroporacijos protokolai su optimizuotais impulsų parametrais
• Sonoporacija naudojant tikslinį ultragarsą
• Magnetofekcija magnetinėmis nanodalelėmis
• Mikroinjekcija, skirta tiksliam vienos ląstelės pristatymui

Tyrimai, atlikti naudojant HEK293 ląsteles, parodė, kad šiuolaikiniais elektroporacijos metodais galima pasiekti didesnį nei 90 % transfekcijos efektyvumą, išlaikant ląstelių gyvybingumą. Tai ypač svarbu jautrioms programoms, pavyzdžiui, CRISPR-Cas9 perdavimui, kai labai svarbu tiksliai kontroliuoti perdavimo parametrus.

Naujausi tyrimai su CCRF-CEM ląstelėmis ir kitomis sustabdytomis ląstelių linijomis parodė, kad optimizuotais fizikiniais pristatymo metodais galima įveikti daugelį apribojimų, susijusių su tradiciniais cheminės transfekcijos metodais, ypač atkuriamumo ir mastelio požiūriu.

Pažymėtina, kad šie metodai ypač veiksmingi Ramoso ląstelėse, kuriose įprasti transfekcijos metodai paprastai būna mažai sėkmingi, o tai rodo jų vertę specializuotuose moksliniuose tyrimuose.

Naujausi technologiniai laimėjimai smarkiai padidino nevirusinių genų pristatymo sistemų transfekcijos efektyvumą. Tyrimai su HeLa ir HepG2 ląstelėmis parodė, kad efektyvumas priartėjo prie virusinių vektorių efektyvumo, o tai yra svarbus etapas šioje srityje.

Pagrindiniai patobulinimai, kurie prisidėjo prie didesnio efektyvumo, yra šie:

• Ląstelėms specifinių taikinių molekulių kūrimas
• Patobulinti endosominiai pabėgimo mechanizmai
• Optimizuotas dalelių dydžio pasiskirstymas
• Naujos formulavimo strategijos, skirtos kompleksų formavimui

Ypač gerų rezultatų pasiekta su HEK293T ląstelėmis, kurių transfekcijos efektyvumas, išlaikant aukštą ląstelių gyvybingumą, viršijo 80 %. Šie patobulinimai ypač reikšmingi tradiciškai sunkiai transfekcijai pasiduodančiose ląstelių linijose, pavyzdžiui, THP-1 ląstelėse, kurių efektyvumas istoriškai buvo mažas.

Naujausi tyrimai, kuriuose buvo lyginami tradiciniai ir pažangūs pateikimo metodai A549 ląstelėse, parodė, kad optimizuotomis nevirusinėmis sistemomis dabar galima pasiekti pastovų daugiau kaip 70 % transfekcijos lygį, o tai yra reikšmingas pagerėjimas, palyginti su ankstesnės kartos vektoriais, kurių efektyvumas paprastai siekdavo tik 20-30 %.

Nevirusinės genų pristatymo sistemos turi įtikinamų ekonominių ir praktinių pranašumų tiek mokslinių tyrimų, tiek klinikinių taikymų srityje. Su HEK293 ląstelėmis atlikti tyrimai parodė, kad, palyginti su virusinių vektorių gamyba, sąnaudos yra gerokai mažesnės, ypač taikant dideliu mastu.

Pagrindiniai ekonominiai ir mastelio keitimo privalumai yra šie:

• Mažesnės vienos partijos gamybos sąnaudos
• Supaprastinti gamybos procesai
• Mažesnė reguliavimo reikalavimų laikymosi našta
• Didesnis stabilumas laikymo ir transportavimo metu
• Lengvesnis didinimas nuo mokslinių tyrimų iki klinikinių kiekių

Išlaidų analizės tyrimai, atlikti naudojant MCF-7 ląsteles ir kitas dažniausiai naudojamas ląstelių linijas, parodė, kad nevirusiniai pristatymo metodai gali sumažinti gamybos sąnaudas iki 60 %, palyginti su virusiniais vektoriais, išlaikant panašų veiksmingumą. Tai ypač akivaizdu didelio masto taikymuose, kur nevirusinių sistemų paprastumas suteikia didelių privalumų gamybos sudėtingumo ir atitikties teisės aktų reikalavimams požiūriu.

Su U2OS ląstelėmis dirbančios mokslinių tyrimų įstaigos pranešė, kad nevirusinėms pristatymo sistemoms reikia mažiau specializuotos įrangos ir žinių, todėl mažesnės pridėtinės išlaidos ir didesnis prieinamumas mažesnėms laboratorijoms. Be to, dėl šių sistemų stabilumo kambario temperatūroje dažnai nereikia specialių laikymo sąlygų, todėl dar labiau sumažėja veiklos sąnaudos.

Neseniai klinikinio masto gamyboje panaudojant HEK293T ląsteles buvo įrodytas sėkmingas padidinimas nuo laboratorinių iki gamybinių kiekių be didelio efektyvumo sumažėjimo, o tai reiškia esminę pažangą šios srities komercinio gyvybingumo srityje.