Mitochondrijų disfunkcijos tyrimai SK neuroblastomos linijose

Mitochondrijos yra ląstelės jėgainė, tačiau jų vaidmuo toli gražu neapsiriboja vien ATP gamyba, bet apima ir svarbias funkcijas apoptozės, kalcio homeostazės ir reaktyviųjų deguonies formų susidarymo srityse. "Cytion" pripažįsta, kad mitochondrijų disfunkcija yra ir neuroblastomos progresavimo veiksnys, ir terapinis pažeidžiamumas, kurį galima panaudoti gydymui. SK neuroblastomos ląstelių linijos, įskaitant SK-N-SH, SK-N-BE(2) ir SK-N-MC, yra svarbios platformos tiriant vaikų vėžio mitochondrijų biologiją ir kuriant į mitochondrijas nukreiptus vaistus.

Pagrindinės išvados

• SK neuroblastomos linijos pasižymi kintančia mitochondrijų funkcija, kuri priklauso nuo diferenciacijos būklės
• MYCN amplifikacija turi įtakos mitochondrijų biogenezei ir metabolizmui
• Mitochondrijų membranos potencialas yra pagrindinis ląstelių sveikatos ir atsako į vaistus rodiklis
• Oksidacinio fosforilinimo ir glikolizės pusiausvyra turi įtakos jautrumui gydymui
• Į mitochondrijas nukreipti junginiai teikia vilčių gydant neuroblastomą

SK Neuroblastomos ląstelių linijų portfelis

SK neuroblastomos ląstelių linijų serija pasižymi didele biologine įvairove, atspindinčia heterogenišką šios vaikų piktybinės ligos pobūdį. Kiekviena linija, atsižvelgiant į jų diferenciacijos būklę, MYCN statusą ir medžiagų apykaitos ypatybes, turi savitų privalumų atliekant mitochondrijų tyrimus.

Mūsų SK-N-SH ląstelės (305028 ) yra vienas plačiausiai naudojamų neuroblastomos modelių, gautas iš kaulų čiulpų metastazių. Ši linija pasižymi dideliu heterogeniškumu, joje yra ir į neuroblastus panašių (N tipo), ir prie substrato prisitvirtinusių (S tipo) ląstelių, pasižyminčių skirtingomis mitochondrijų savybėmis. SK-N-SH ląsteles galima paskatinti diferencijuotis naudojant retinoinę rūgštį, todėl galima tirti, kaip diferenciacija veikia mitochondrijų funkciją.

SK-N-BE(2) ląstelėse (305058 ) yra MYCN amplifikacija - svarbus neuroblastomos prognozės žymuo, kuris daro didelę įtaką mitochondrijų biologijai. MYCN skatina genų, dalyvaujančių mitochondrijų biogenezėje ir veikloje, raišką, taip sukurdamas unikalias metabolines priklausomybes, kurias galima panaudoti terapijoje.

Dopaminerginių neuronų modelių atveju SH-SY5Y ląstelės (300154), SK-N-SH subklonas, plačiai naudojamos Parkinsono ligos ir neurotoksiškumo tyrimuose, kuriuose mitochondrijų disfunkcija atlieka pagrindinį vaidmenį.

Mitochondrijų membranos potencialo vertinimas

Mitochondrijų membranos potencialas (ΔΨm) yra pagrindinis mitochondrijų sveikatos ir funkcijos rodiklis. Elektrocheminis gradientas per vidinę mitochondrijos membraną, kurį sukuria elektronų pernašos grandinė, skatina ATP sintezę ir reguliuoja daugybę mitochondrijos procesų.

Naudojant JC-1 dažiklį, galima ratiometriškai įvertinti ΔΨm SK neuroblastomos ląstelėse. Sveikose mitochondrijose, kuriose yra didelis ΔΨm, JC-1 agregatai skleidžia raudoną fluorescenciją; depoliarizuotose mitochondrijose, kuriose yra mažas ΔΨm, yra JC-1 monomerų, skleidžiančių žalią fluorescenciją. Raudonos ir žalios spalvų santykis kiekybiškai nusako membranos potencialą įvairiose ląstelių populiacijose.

TMRE (tetrametilrhodamino etilo esteris) siūlo alternatyvų metodą, kurio analizė paprastesnė. Šis ląsteles praleidžiantis dažiklis kaupiasi poliarizuotose mitochondrijose proporcingai ΔΨm. Srauto citometrija arba plokštelių skaitytuvo matavimai leidžia atlikti didelio našumo vaistų poveikio mitochondrijų poliarizacijai vertinimą.

Mitochondrijų poliarizacija dažnai vyksta prieš apoptozę, todėl ΔΨm matavimas yra vertingas nustatant junginius, kurie sukelia vidinius apoptozės kelius. SK neuroblastomos ląstelėms, apdorotoms chemoterapiniais preparatais, būdingas ΔΨm praradimas prieš aktyvuojant kaspazes ir ląstelės žūtį.

Oksidacinis fosforilinimas ir metabolinis profiliavimas

"Seahorse" ekstraląstelinio srauto analizė iš esmės pakeitė mitochondrijų kvėpavimo vertinimą nepažeistose ląstelėse. Vienu metu matuodami deguonies suvartojimo greitį (OCR) ir ekstraląstelinio rūgštėjimo greitį (ECAR), tyrėjai gali sudaryti oksidacinio fosforilinimo ir glikolizės santykinį indėlį į ląstelių energijos gamybą.

Mito streso teste nuosekliai pridedama oligomicino (ATP sintazės inhibitoriaus), FCCP (atjungiklio) ir rotenono / antimicino A (I ir III komplekso inhibitorių), kad būtų galima apskaičiuoti pagrindinius parametrus, įskaitant bazinį kvėpavimą, su ATP susijusį kvėpavimą, maksimalų kvėpavimo pajėgumą ir rezervinį kvėpavimo pajėgumą.

SK neuroblastomos linijos skiriasi savo priklausomybe nuo OXPHOS. MYCN amplifikuotos linijos, pavyzdžiui, SK-N-BE(2), dažnai pasižymi padidėjusiu mitochondrijų kvėpavimu, kuris palaiko jų didelius proliferacinius poreikius. Šis metabolinis fenotipas sukuria pažeidžiamumą OXPHOS inhibitoriams, kurį galima panaudoti terapijoje.

Metabolinį lankstumą galima įvertinti kultivuojant ląsteles terpėje, kurioje nėra gliukozės ir galaktozės, kuri priverčia pasikliauti OXPHOS. Ląstelių linijos su mitochondrijų disfunkcija tokiomis sąlygomis blogiau auga, todėl galima atlikti funkcinę mitochondrijų defektų atranką.

Reaktyviosios deguonies rūšys ir oksidacinis stresas

Mitochondrijos yra pagrindiniai reaktyviųjų deguonies formų (ROS) šaltiniai ir taikiniai. Elektronų nuotėkis iš kvėpavimo grandinės generuoja superoksidą, kuris gali pažeisti mitochondrijų DNR, baltymus ir lipidus, todėl susidaro užburtas mitochondrijų disfunkcijos ir ROS susidarymo ratas.

MitoSOX Red specifiškai aptinka superoksidą mitochondrijose, todėl SK neuroblastomos ląstelėse galima įvertinti mitochondrijų ROS gamybą. Padidėjusi MitoSOX fluorescencija rodo oksidacinį stresą, kuris gali turėti įtakos ligos patogenezei arba reakcijai į vaistus.

Ląstelių redokso būklę lemia pusiausvyra tarp ROS gamybos ir antioksidacinės apsaugos. Mitochondrijų superoksido dismutazė (SOD2) superoksidą paverčia vandenilio peroksidu, kurį vėliau detoksikuoja glutationo peroksidazės. SK neuroblastomos ląstelės skiriasi savo antioksidaciniu pajėgumu, o tai turi įtakos jautrumui oksidaciniam stresui.

Prooksidacinėmis terapinėmis strategijomis siekiama įveikti vėžio ląstelių antioksidacinę apsaugą. Junginiai, didinantys mitochondrinį ROS, įskaitant tam tikrus chemoterapinius ir tikslinius preparatus, gali pasižymėti didesniu veiksmingumu ląstelėse, kurių redokso pusiausvyra jau pažeista.

Į mitochondrijas nukreipta terapija

Dėl unikalių mitochondrijų savybių galima kurti į organelę nukreiptus gydymo metodus. Mitochondrijose kaupiasi lipofiliniai katijonai, kuriuos lemia membranos potencialas, todėl tai yra taikinio mechanizmas terapiniams preparatams.

BH3 mimetikai, tokie kaip venetoklaksas, veikia antiapoptozinius BCL-2 šeimos baltymus mitochondrijose, išlaisvindami proapoptozinius veiksnius ir sukeldami ląstelių mirtį. SK neuroblastomos ląstelės išreiškia skirtingą BCL-2 šeimos narių kiekį, o tai turi įtakos jautrumui šiems tiksliniams preparatams.

I komplekso inhibitoriai, įskaitant metforminą ir fenforminą, sutrikdo mitochondrijų ATP gamybą. MYCN amplifikuotos neuroblastomos ląstelės, kuriose padidėjusi OXPHOS priklausomybė, gali pasižymėti ypatingu jautrumu šioms metabolinėms intervencijoms.

Rekomenduojami produktai neuroblastomos mitochondrijų tyrimams:

• SK-N-SH ląstelės (305028) - heterogeninis neuroblastomos modelis
• SK-N-BE(2) ląstelės (305058) - MYCN amplifikuotas modelis
• SH-SY5Y ląstelės (300154) - dopaminerginė neuroblastoma
• SK-N-MC ląstelės (300340) - neuronų fenotipas