HEK293 medžiagų apykaitos inžinerija, siekiant pagerinti baltymų glikozilinimą

Glikozilinimas yra viena svarbiausių potransliacinių modifikacijų, turinčių įtakos terapinių baltymų veiksmingumui, stabilumui ir imunogeniškumui. "Cytion" supranta, kad norint pagaminti rekombinantinius baltymus su optimaliais glikanų profiliais, reikia gerai išmanyti ląstelių metabolizmą ir glikozilinimo mechanizmą. HEK293 ląstelės yra unikali glikoproteinų gamybos platforma, nes jų žmogiška kilmė užtikrina glikozilinimo modelius, kurie tiksliai atspindi endogeninius žmogaus baltymus, o tai yra esminis pranašumas, palyginti su nežmogiškomis raiškos sistemomis.

Pagrindinės išvados

• HEK293 ląstelės tam tikriems terapiniams preparatams gaminti sukuria su žmogumi suderinamas glikanų struktūras, kurios yra pranašesnės už CHO ląsteles
• Nukleotidinių cukrų pirmtakų papildymas tiesiogiai padidina glikozilinimo vietų užimtumą
• Kultūros sąlygos, įskaitant temperatūrą, pH ir ištirpusį deguonį, daro didelę įtaką glikanų profiliams
• Genų inžinerijos metodai leidžia pritaikyti glikanų struktūras konkrečioms terapinėms reikmėms
• Analitinio apibūdinimo strategijos yra labai svarbios glikoproteinų kokybei įvertinti

HEK293 ląstelių glikozilinimo pranašumas

Žmogaus embrioninių inkstų 293 ląstelės pasižymi išskirtinėmis glikozilinimo savybėmis, kurios jas išskiria iš kitų žinduolių raiškos sistemų. Skirtingai nei Kinijos žiurkėnų kiaušinėlių (CHO) ląstelės, kurios išskirtinai gamina tik α2,3 silicio rūgštis, HEK293 ląstelės ekspresuoja ir α2,3, ir α2,6-sialiltransferazes, todėl susidaro glikanų struktūros, labiau primenančios natūralius žmogaus glikoproteinus.

Šis skirtumas turi svarbią terapinę reikšmę. Daugelyje žmogaus serumo glikoproteinų, įskaitant imunoglobulinus ir krešėjimo faktorius, yra daug α2,6 sialo rūgšties. Todėl HEK293 ląstelėse pagaminti terapiniai baltymai gali pasižymėti geresniais farmakokinetiniais profiliais ir mažesniu imunogeniškumu, palyginti su CHO išvestais analogiškais baltymais.

Mūsų HEK293 ląstelės (300192 ) yra puikus pradinis glikoproteinų gamybos taškas, pasižymintis tvirtomis augimo savybėmis ir išlaikantis vietinį glikozilinimo mechanizmą. Jei reikia didesnio transfekcijos efektyvumo, mūsų HEK293T ląstelės (300189) leidžia greitai atlikti ekspresijos tyrimus.

Nukleotidų cukraus apykaita ir pirmtakų inžinerija

Glikozilinimo efektyvumas iš esmės priklauso nuo to, ar endoplazminiame tinkle ir Golgio aparate yra nukleotidinių cukrų donorų. Šios aktyvuotos cukraus molekulės, įskaitant UDP-gliukozę, UDP-galaktozę, UDP-N-acetilgliukozaminą, GDP-manozę, GDP-fukozę ir CMP-sialo rūgštį, yra glikoziltransferazių, konstruojančių glikanų grandines, substratai.

Metabolinės inžinerijos metodais galima padidinti nukleotidinių cukrų kiekį keliais mechanizmais. Tiesiogiai papildant kultūrinę terpę monosacharidais, tokiais kaip galaktozė, manozė ar N-acetilmanozaminas (ManNAc), gaunami gelbėjimo kelio substratai, kuriuos ląstelės gali paversti atitinkamais nukleotidų cukrais. Įrodyta, kad 10-40 mM ManNAc papildymas gerokai padidina sialilinimo lygį įvairiose ląstelių linijose.

Genetiniais metodais galima rasti pastovesnių sprendimų. Pagrindinių nukleotidinių cukrų biosintezės kelio fermentų, įskaitant CMP-sialio rūgšties sintezę, UDP-gliukozės pirofosforilazę arba GDP-manozės pirofosforilazę, perteklinė ekspresija gali tvariai padidinti pirmtakų kiekį, nereikalaujant terpės papildymo.

Kultūros sąlygų optimizavimas glikanų kokybei užtikrinti

Aplinkos parametrai daro didelę įtaką glikozilinimo rezultatams, o jų poveikis glikanų profiliams dažnai prilygsta genetinėms modifikacijoms. Įrodyta, kad temperatūros sumažinimas nuo 37 °C iki 32-34 °C gamybos etape nuolat didina sialilinimą, greičiausiai dėl pailgėjusio baltymų buvimo Golgi ir sumažėjusio sialidazės aktyvumo.

Kultūros pH turi įtakos ir glikoziltransferazės aktyvumui, ir glikanų stabilumui. Palaikant pH nuo 6,8 iki 7,2, paprastai palaikomas optimalus glikozilinimas, nors konkretus optimumas gali skirtis priklausomai nuo tikslinio baltymo ir norimo glikano profilio. pH reikšmės, mažesnės nei 6,5, gali paskatinti sialo rūgšties skilimą, sumažindamos terminalinį sialilinimą.

Ištirpusio deguonies kiekis turi įtakos ląstelių medžiagų apykaitai, taigi ir glikozilinimui. Hipoksinės sąlygos (mažiau nei 20 % oro prisotinimas) gali pakenkti ląstelių augimui ir produktyvumui, o vidutinis deguonies kiekis (30-50 % oro prisotinimas) paprastai palaiko stiprų glikozilinimą. Hiperoksinėmis sąlygomis gali susidaryti reaktyvių deguonies formų, kurios pažeidžia glikoproteinus arba trikdo glikozilinimo mechanizmą.

Mūsų DMEM:Ham's F12 (1:1) terpė (820400a ) yra puiki bazinė glikoproteinų gamybos terpė, pasižyminti subalansuota maistinių medžiagų sudėtimi, kuri palaiko ir ląstelių augimą, ir posttransliacinį apdorojimą.

Genų inžinerija individualiam glikozilinimui

Šiuolaikinės genų inžinerijos priemonės leidžia tiksliai modifikuoti HEK293 glikozilinimo gebėjimus, kad būtų galima gaminti baltymus su pritaikyta glikano struktūra. CRISPR/Cas9 technologija sukėlė revoliuciją šioje srityje, leisdama veiksmingai išstumti konkrečias glikoziltransferazes arba įdiegti naujas fermentines veiklas.

Afukozilinti antikūnai yra vienas iš svarbiausių glikoinžinerijos taikymo būdų. FUT8 geno, koduojančio α1,6-fukoziltransferazę, nukautavimas pašalina N-glikanų fukozilinimą. Afukozilinti antikūnai pasižymi žymiai didesniu nuo antikūnų priklausomu ląstelių citotoksiškumu (ADCC), o tai yra pageidautina savybė onkologiniams vaistams.

Ir atvirkščiai, pernelyg didelė glikoziltransferazių ekspresija gali sustiprinti specifines modifikacijas. Įvedus β1,4-N-acetilgliukozaminiltransferazę III (GnT-III), gaunami antikūnai, kurių N-acetilgliukozaminas yra dvilytis, o tai yra dar viena modifikacija, susijusi su geresne efektorine funkcija. Galaktoziltransferazių ir sialiltransferazių perteklinė ekspresija padidina galinio glikoglikoglikoglikozės dangtelio kiekį, o tai gali pagerinti serumo pusinės eliminacijos laiką.

Glikoproteinų gamybai dideliais kiekiais skirtos pakabinamos kultūros, mūsų HEK293 pakabinamos adaptuotos ląstelės (300686) gali būti toliau modifikuojamos taip, kad jose būtų įdiegtos pageidaujamos glikozilinimo modifikacijos.

Glikozilinimo vertinimo analitinės strategijos

Visapusiškam glikanų apibūdinimui reikalingi keli vienas kitą papildantys analitiniai metodai. Glikanų analizė naudojant hidrofilinės sąveikos skysčių chromatografiją (HILIC) su fluorescencijos aptikimo funkcija leidžia atlikti išsamų glikanų profiliavimą, pasižymintį dideliu jautrumu. Masės spektrometrija suteikia papildomą struktūrinį patvirtinimą ir leidžia nustatyti netikėtas modifikacijas.

Glikozilinimo analizė pagal glikozilinimo vietą padeda spręsti glikoproteinams būdingo heterogeniškumo problemą. Glikopeptidų žemėlapio sudarymas naudojant LC-MS/MS atskleidžia atskirų glikozilinimo vietų užimtumą ir kiekvienoje vietoje esančias glikano struktūras. Ši informacija yra labai svarbi norint suprasti struktūros ir funkcijos ryšius ir užtikrinti skirtingų partijų nuoseklumą.

Greiti atrankinės patikros metodai padeda plėtoti procesus ir kontroliuoti kokybę. Lektinais pagrįsti tyrimai, kapiliarinė elektroforezė ir glikanams būdingi antikūnai leidžia atlikti didelio našumo pagrindinių glikanų savybių vertinimą, nereikalaujant didelio mėginių paruošimo.

Rekomenduojami produktai glikoproteinų gamybai:

• HEK293 ląstelės (300192) - prigimtiniai žmogaus glikozilinimo modeliai
• HEK293T ląstelės (300189) - didelis transfekcijos efektyvumas greitiems tyrimams
• HEK293 suspensijai pritaikytos HEK293 (300686 ) - keičiamo dydžio gamybos platforma
• DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a) - Optimizuota glikoproteinų gamybai