Eiti į pagrindinį puslapį
Pirkinių krepšelis 0,00 €*
Rodyti visas kategorijas HEK ląstelių pagrįstos didelio našumo GPCR atrankos platformos Atgal

HEK ląstelėmis pagrįstos didelio našumo GPCR patikros platformos

Su G baltymais surišti receptoriai (GPCR) yra didžiausia membraninių baltymų šeima žmogaus genome ir sudaro maždaug 34 % visų vaistų taikinių. "Cytion" pripažįsta, kad kuriant veiksmingus į GPCR nukreiptus vaistus reikia patikimų ląstelių atrankos platformų, galinčių tiksliai išmatuoti receptorių aktyvaciją tūkstančiuose ir milijonuose junginių. HEK293 ląstelės tapo tinkamiausiu GPCR raiškos ir funkcinės patikros šeimininku, nes pasižymi unikaliu veiksmingos receptorių raiškos, mažo endogeninių receptorių fono ir suderinamumo su įvairiais tyrimų formatais deriniu.

Pagrindinės išvados

  • HEK293 ląstelės yra idealus fonas heterologinių GPCR raiškai, o endogeninių receptorių trukdžiai yra minimalūs
  • Keli tyrimų formatai - kalcio srautas, cAMP, β-arrestino įdarbinimas - leidžia atlikti išsamią kelio apklausą
  • Automatizuotas skysčių tvarkymas ir plokštelių skaitytuvai leidžia patikrinti daugiau kaip 100 000 junginių per dieną
  • Stabilios ląstelių linijų kūrimo strategijos suderina našumo reikalavimus su tyrimų nuoseklumu
  • Šališkam agonizmo aptikimui reikia daugkartinių rodmenų, apimančių įvairias signalizavimo kaskadas
HEK293 pagrindu sukurta GPCR didelio našumo atrankinės patikros platforma GPCR signalizacijos keliai GPCR Gαs ↑cAMP Gαq ↑Ca²⁺ β-arr Įdarbinti Tyrimo technologijos Kalcio srautas Fluo-4/Fura-2 FLIPR/plokštelių skaitytuvas cAMP tyrimai HTRF/AlphaScreen GloSensor β-arestinas PathHunter BRET/NanoBiT Reporterio genas CRE-Luc NFAT-Luc HTS darbo eiga Ląstelių sėjimas 384/1536 duobutės Junginys Papildymas Aptikimas Skaitymas Analizė Patikimų atrinkimas HEK293 privalumai atliekant GPCR atranką Mažas fonas Minimalus endogeninių GPCR raiška Švarus signalo ir triukšmo santykis Didelė ekspresija Efektyvi transfekcija Stiprūs CMV promotoriai 10⁵-10⁶ receptorių ląstelėje Visiškas signalizavimas Visi G baltymų potipiai Adaptorių baltymai Natūralus kelio ryšys Suderinamumas su tyrimais Patikimas mikrodalelėse Prisitaikymas prie suspensijos Automatizuotas apdorojimas Atrankos našumo rodikliai Formatas Duobutės/plokštelė Junginiai per dieną 96 duobučių 96 5,000-10,000 384 duobutės 384 20,000-50,000 1536 šulinys 1536 100,000-500,000 3456 šulinys 3456 500,000-1,000,000+ Stabilios ląstelių linijos kūrimas 1. Vektorių dizainas su atrankos žymekliu 2. HEK293 tėvinių ląstelių transfekcija 3. Antibiotikų atranka (2-4 savaitės) 4. Vienos ląstelės klonavimas (FACS / ribinis praskiedimas) 5. Klonų atranka dėl raiškos ir (arba) funkcijos 6. Ląstelių bankininkystė ir stabilumo tyrimai Terminai: 3-6 mėnesiai © "Cytion" - galimybė atrasti GPCR vaistus

Kodėl HEK293 ląstelės puikiai tinka GPCR atrankai

HEK293 ląstelės tapo de facto GPCR funkcinių tyrimų standartu dėl kelių joms būdingų privalumų. Pirma, jų santykinai maža endogeninė GPCR raiška sumažina foninį signalą, kuris gali trukdyti heterologinių receptorių tyrimams. Skirtingai nei tam tikros vėžinės kilmės ląstelių linijos, kuriose funkciniu požiūriu svarbiais lygiais ekspresuojama daug GPCR, HEK293 ląstelės yra švarus receptorių raiškos audinys.

Antra, HEK293 ląstelės išreiškia visus pagrindinius G baltymų poklasius (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) tokiais kiekiais, kurių pakanka įvairiems receptorių ryšiams palaikyti. Šis išsamus signalų repertuaras leidžia tirti natūralias receptorių ir baltymų sąveikas, nereikalaujant specifinių G baltymų subvienetų ekspresijos.

Trečia, HEK293 ląstelės efektyviai transfekuojamos naudojant įvairių klasių reagentus, o transfekcijos dažnis viršija 90 %. Toks efektyvumas lemia aukštą receptorių raiškos lygį - paprastai nuo 10⁵ iki 10⁶ receptorių vienoje ląstelėje, todėl net ir nedidelio ryšio efektyvumo receptoriams užtikrinamas tvirtas signalo langas.

Mūsų HEK293T ląstelės (300189 ) pasižymi ypač dideliu transfekcijos efektyvumu pereinamajam GPCR išraiškos procesui, todėl jos idealiai tinka pradiniam receptorių apibūdinimui ir tyrimų kūrimui prieš pradedant kurti stabilias ląstelių linijas.

Tyrimo formato parinkimas GPCR atrankai

Kalcio srauto tyrimai: Gαq surišti receptoriai aktyvuoja fosfolipazę C, sukeldami kalcio išsiskyrimą iš viduląstelinių atsargų. Kalciui jautrūs fluorescenciniai dažai, tokie kaip Fluo-4, Fura-2 arba genetiškai užkoduoti kalcio indikatoriai, leidžia išmatuoti šią reakciją realiuoju laiku. Plokštelėmis pagrįsti fluorescencijos skaitytuvai, tokie kaip FLIPR, gali vienu metu matuoti kalcio pereinamuosius procesus visose 384 arba 1536 duobučių plokštelėse, o jų našumas viršija 100 000 duomenų taškų per dieną.

cAMP tyrimai: Gαs surišti receptoriai stimuliuoja adenililciklazę, didindami viduląstelinį cAMP, o Gαi surišti receptoriai slopina cAMP gamybą. CAMP pokyčius galima nustatyti naudojant įvairias tyrimų technologijas, įskaitant konkurencinius imunoanalizės metodus (HTRF, AlphaScreen), biojutikliu pagrįstus metodus ("GloSensor") ir reporterinių genų tyrimus (CRE-luciferazė). Kiekvienas iš jų pasižymi savitais jautrumo, kinetikos ir našumo pranašumais.

β-arrestino įdarbinimas: GPCR aktyvavimas sukelia β-arrestino pritraukimą prie receptoriaus, o šį procesą galima išmatuoti atliekant baltymų papildymo tyrimus. Tokios technologijos, kaip PathHunter (fermentų fragmentų komplementacija) ir NanoBiT (suskaidyta luciferazė), užtikrina jautrius, nuo kelio nepriklausomus rodmenis, taikomus visoms receptorių klasėms, neatsižvelgiant į G baltymo sujungimo pirmenybę.

Reporterio genų tyrimai: Transkripcijos reporterių sistemos matuoja tolesnius signalizavimo įvykius ir užtikrina jautrumą didinantį amplifikavimą. CRE-luciferazės reporteriai nustato cAMP kelio suaktyvėjimą, NFAT-luciferazė reaguoja į kalcio signalus, o SRE-luciferazė stebi kelis kelius. Nors ir lėtesni nei tiesioginiai antrųjų pasiuntinių matavimai, reporterių tyrimai užtikrina puikų signalo ir fono santykį.

Stabilių ląstelių linijų kūrimo strategijos

Didelio našumo patikros kampanijoms paprastai reikia stabilių ląstelių linijų, kurios išreikštų tikslinę GPCR pastoviais lygiais milijarduose tyrimo duobučių. Stabilių linijų kūrimas prasideda nuo vektoriaus, kuriame yra ir receptorius, ir pasirenkamasis žymeklis, kūrimo, kad būtų galima gausinti stabiliai transfekuotas ląsteles.

Mūsų HEK293 ląstelės (300192 ) yra standartinė tėvinė linija stabilioms ląstelių linijoms kurti. Po transfekcijos ir atrankos antibiotikais (paprastai 2-4 savaites) išlikusios ląstelės klonuojamos į vieną ląstelę, taikant ribinį praskiedimą arba fluorescencija aktyvuotą ląstelių rūšiavimą (FACS). Tada atskiri klonai išplečiami ir apibūdinami pagal receptorių raiškos lygį, funkcinio atsako dydį ir tyrimo patikimumą.

Svarbiausi kokybės požymiai ląstelių linijų atrankai yra raiškos stabilumas per ilgesnį ciklą, nuosekli farmakologija, palyginti su etaloniniais standartais, ir patikimas veikimas miniatiūrinėse plokštelėse. Siekiant užtikrinti nuoseklų veikimą visos atrankos kampanijos pradžioje, reikėtų sukurti kvalifikuotų ląstelių bankus.

Siekiant pagreitinti terminus, mūsų HEK293 EBNA ląstelės (300264 ) užtikrina stabilią raišką iš epizominių vektorių, todėl gali sutrumpėti kūrimo terminai, išlaikant raiškos nuoseklumą.

Miniatiūrizacijos ir automatizavimo aspektai

Norint maksimaliai padidinti tyrimų našumą, reikia miniatiūrizuoti iki 384 duobučių, 1536 duobučių ar net 3456 duobučių formatų. HEK293 ląstelės gerai prisitaiko prie didelio tankio dengimo mažesniais kiekiais, tačiau kiekvienu atveju gali prireikti optimizuoti ląstelių tankį, dengimo sąlygas ir inkubacijos laiką.

HEK293 ląstelės, pritaikytos suspensijai, turi privalumų automatizuotoms atrankos darbo eigoms. Mūsų HEK293 ląstelės, pritaikytos suspensijai (300686 ), gali būti dozuojamos tiesiai iš kultūros indų į tyrimo lėkšteles be tripsinizacijos, todėl sumažėja tvarkymo etapų ir pagerėja nuoseklumas. Šis suderinamumas su automatizuotais skysčių tvarkytuvais suteikia galimybę vykdyti tikras atrankinės patikros kampanijas.

Tyrimo plokštelių stabilumo reikalavimai skiriasi priklausomai nuo formato. Kalcio srauto tyrimus paprastai reikia atlikti per kelias valandas nuo dažiklio įkėlimo, o cAMP ir β-arrestino tyrimus galima inkubuoti per naktį prieš nuskaitymą. Šių apribojimų supratimas padeda suprasti atrankinės patikros logistiką ir įrangos planavimą.

Duomenų analizė ir laimėjimų nustatymas

GPCR atrankos kampanijų metu gaunami didžiuliai duomenų rinkiniai, kuriems reikia patikimų analizės vamzdynų. Statistiniai parametrai, įskaitant Z'-faktorių, signalo ir fono santykį bei variacijos koeficientą, įvertina tyrimo kokybę kiekvienoje plokštelėje atskirai. Plokštelės, neatitinkančios kokybės ribų, turėtų būti kartojamos, o ne analizuojamos.

Patikimumo nustatymo kriterijai subalansuoja jautrumą ir klaidingai teigiamų rezultatų skaičių. 50 % aktyvumo arba slopinimo ribos, palyginti su etaloniniais junginiais, yra tinkami pradiniai taškai, nors optimalios ribos priklauso nuo bibliotekos sudėties ir programos tikslų. Pirminių hitų koncentracijos ir atsako patvirtinimas pašalina artefaktus ir paskirsto junginius tolesniems veiksmams.

Šiuolaikiniame GPCR vaistų paieškos procese vis labiau pabrėžiamas šališkas agonizmas - junginiai, kurie pirmenybę teikia tam tikriems signalų keliams, o ne kitiems. Norint aptikti šališkus junginius, reikia lygiagrečių tyrimų, kuriais matuojami keli keliai (pvz., G baltymo aktyvinimas ir β-arrestino įdarbinimas), atidžiai atsižvelgiant į tyrimų jautrumą ir kinetiką, kad būtų išvengta techninio šališkumo.

Rekomenduojami produktai GPCR atrankai:

Šioje svetainėje naudojami slapukai, kad užtikrintume geriausią svetainės naudojimo patirtį... Daugiau informacijos.
- Imprint

Nustatėme, kad esate kitoje šalyje arba naudojate kitą naršyklės kalbą nei šiuo metu pasirinkta. Ar norite priimti siūlomus nustatymus?

Uždaryti