Fluorescencinių ląstelių kriokonservavimas

Norint išsaugoti fluorescencines ląsteles, reikia kruopščiai apgalvoti kriokonservavimo procesą ir fluorescencinių baltymų stabilumo palaikymą. "Cytion" sukūrėme optimizuotus protokolus, kad užtikrintume, jog jūsų fluorescenciniu žymeniu pažymėtos ląstelės po atšildymo išlaikytų ir gyvybingumą, ir fluorescencijos intensyvumą.

Fluorescuojančių baltymų stabilumas kriokonservavimo metu

Fluorescenciniai baltymai, ypač GFP ir jo atmainos, pasižymi ypatingu stabilumu atliekant tinkamas kriokonservavimo procedūras. Mūsų "Cytion" atlikti tyrimai, ypač su tokiomis ląstelių linijomis kaip HK EGFP-alfa-tubulino/H2B-mCherry ląstelės ir HK EGFP-H2B ląstelės, rodo, kad fluorescenciniai baltymai išlaiko savo struktūrinį vientisumą, kai užšaldomi optimaliomis sąlygomis. Sėkmingo išsaugojimo raktas yra tinkamų krioprotektorių naudojimas ir standartizuotų protokolų laikymasis. Rekomenduojame naudoti užšaldymo terpę CM-1, kuri specialiai sukurta ląstelių struktūroms apsaugoti ir baltymų stabilumui išlaikyti šaldymo proceso metu. Taikant tinkamus kriokonservavimo metodus, fluorescencinių baltymų raiška po atšildymo paprastai išlieka didesnė nei 90 % prieš užšaldymą buvusio lygio.

Šaldymo terpės sudėties svarba fluorescencijos išsaugojimui

Šaldymo terpės sudėtis yra labai svarbi išsaugant ląstelių gyvybingumą ir fluorescencijos intensyvumą. "Cytion" sukūrėme specializuotas kriokonservavimo terpes, kuriose sprendžiami unikalūs fluorescencinių ląstelių išsaugojimo uždaviniai. Mūsų užšaldymo terpė CM-ACF, be serumo, buvo specialiai optimizuota fluorescenciniams baltymams apsaugoti šaldymo proceso metu. Jautrioms fluorescencinių ląstelių linijoms, tokioms kaip HK EGFP-Cap-D2 ląstelės, rekomenduojame naudoti mūsų užšaldymo terpę CM-1 - 100 ml, kurioje yra optimizuotos koncentracijos krioprotektorių, neleidžiančių susidaryti ledo kristalams ir išlaikančių fluoroforų stabilumą. Subalansuotas terpės osmoliariškumas ir apsauginės medžiagos užtikrina, kad fluorescenciniai baltymai išlaikytų savo prigimtinę konformaciją viso užšaldymo ir atšildymo proceso metu, todėl po atšildymo gaunami pastovūs fluorescencijos signalai.

Kontroliuojamo greičio užšaldymas: Fluorescencijos išsaugojimui būtinas šaldymas: esminis fluorescencijos išlaikymo veiksnys

Kontroliuojamo greičio šaldymas yra labai svarbus siekiant išlaikyti fluorescencinių baltymų vientisumą kriokonservavimo metu. "Cytion" atlikti tyrimai su fluorescencinių ląstelių linijomis, tokiomis kaip NRK-EGFP-H2B ląstelės ir U2OS-CRISPR-NUP96-SNAP klono Nr. 33 ląstelės, rodo, kad šaldymo greitis -1 °C per minutę yra optimalus fluorescencijos intensyvumui išsaugoti. Šis kontroliuojamas metodas kartu su mūsų šaldymo terpe CM-ACF - be serumo - 100 ml sumažina žalingų ledo kristalų, kurie gali paveikti baltymų struktūrą, susidarymą. Rekomenduojame naudoti izopropanolio šaldymo indą arba programuojamą šaldiklį, kad pasiektumėte pastovų šaldymo greitį. Šis metodas ypač veiksmingas norint išsaugoti sudėtingas fluorescencinių baltymų konfigūracijas, tokias kaip mūsų HK EGFP-LaminA/H2B-mCherry ląstelėse.

Specialūs GFP ir RFP ekspresiją turinčių ląstelių tvarkymo aspektai

Skirtingiems fluorescenciniams baltymams reikia specialių tvarkymo būdų, kad jie būtų optimaliai išsaugoti. Mūsų "Cytion" patirtis su tokiomis ląstelėmis kaip HK EGFP-LaminB1/H2B-mCherry ląstelės rodo, kad GFP variantai kriokonservavimo metu yra stabilesni nei RFP variantai. GFP ekspresiją turinčioms ląstelėms rekomenduojame naudoti mūsų užšaldymo terpę CM-ACF - be serumo - 100 ml, kuri užtikrina geresnę fluoroforo struktūros apsaugą. RFP ekspresijos ląstelėms, pavyzdžiui, mūsų HK-CRISPR-Pom121-mCherry #32 ląstelėms, naudinga į šaldymo terpę pridėti antioksidantų, kad būtų išvengta fluoroforo irimo. Pagrindiniai tvarkymo skirtumai yra šie:

• GFP išreiškiančios ląstelės: Standartinis šaldymo greitis (-1 °C/min) su terpe be serumo
• RFP ekspresijos ląstelės: Šiek tiek greitesnis šaldymas (-1,5 °C/min) su antioksidantais papildyta terpe
• Abiejų tipų: Minimalus šviesos poveikis tvarkant
• Apsauga nuo pH svyravimų šaldymo metu

Atsigavimo po atšildymo laikotarpiai ir fluorescencijos įvertinimas

Po kriokonservavimo fluorescencinėms ląstelėms reikia tam tikrų atsigavimo laikotarpių, kad jos atgautų optimalų fluorescencijos intensyvumą. Mūsų tyrimai su HEK293 ląstelėmis, ekspresuojančiomis fluorescencinius baltymus, rodo, kad labai svarbus 24-48 valandų atsigavimo laikotarpis. Per šį laiką ląstelės turėtų būti palaikomos visavertėje augimo terpėje, papildytoje standartiniais antibiotikais. Pastebėjome, kad fluorescencijos intensyvumas paprastai pasiekia aukščiausią lygį maždaug po 72 valandų po atšildymo, ypač tokiose ląstelių linijose, kaip HEK293T ląstelės, ekspresuojančios GFP variantus.

Fluorescencinių ląstelių išsaugojimo strategijos optimizavimas

Sėkmingas fluorescencinių ląstelių išsaugojimas priklauso nuo visapusiško kriokonservavimo metodo. "Cytion" rekomenduoja naudoti mūsų užšaldymo terpę CM-1 kartu su kontroliuojamo greičio užšaldymo protokolais. Reguliarus fluorescencijos išlaikymo patvirtinimas naudojant srauto citometriją arba fluorescencinę mikroskopiją užtikrina nuoseklius rezultatus. Specializuotoms reikmėms mūsų techninės pagalbos komanda gali pateikti individualius protokolus, pritaikytus konkrečioms fluorescencinių ląstelių linijoms. Atminkite, kad tinkamas elgesys viso proceso metu - nuo paruošimo prieš užšaldymą iki atstatymo po atšildymo - yra labai svarbus ląstelių gyvybingumui ir fluorescencijos intensyvumui išlaikyti. Pasitikėkite "Cytion" patirtimi ir produktais, kurie padės jums pasiekti optimalių fluorescencinių ląstelių išsaugojimo rezultatų.