Dviejų reporterių sistemos, skirtos ko-kultūrų vaizdavimui
"Cytion" pastebėjo, kad ląstelių biologijos tyrimuose pastebima didelė tendencija naudoti bendrakultūrinius modelius. Šios pažangios sistemos leidžia mokslininkams tirti ląstelių sąveiką aplinkoje, kuri labiau primena in vivo sąlygas. Labai svarbus šių tyrimų komponentas yra dvigubo reporterio sistemos, kurios leidžia aiškiai vizualiai atskirti skirtingas ląstelių populiacijas. Šiame straipsnyje nagrinėjamos dvigubo reporterio technologijos ir jų taikymas ko-kultūrų vaizdavimui.
| Pagrindinės išvados: Dviejų reporterių sistemos |
|---|
|
Dviejų pranešėjų sistemų supratimas
Dvigubo reporterio sistemose naudojami fluorescencinių baltymų ar kitų reporterio molekulių deriniai, kad būtų galima atskirti skirtingas ląstelių populiacijas mišriose kultūrose. Šios sistemos iš esmės pakeitė mūsų galimybes stebėti ląstelių sąveiką realiuoju laiku ir leidžia suprasti sudėtingus biologinius procesus, pavyzdžiui, naviko ir kamieno sąveiką, imuninių ląstelių sąveiką ir vystymosi signalus. Ženklindami skirtingus ląstelių tipus skirtingais reporteriais, tokiais kaip GFP ir RFP, mokslininkai gali stebėti jų elgesį, judėjimą ir sąveiką beprecedenčiu aiškumu. "Cytion" siūlo keletą ląstelių linijų, specialiai sukurtų stabiliai reporterių raiškai, kad palengvintų šiuos sudėtingus bendrakultūrinius tyrimus.
Populiariausi fluorescencinių reporterių deriniai
Sėkmingiems eksperimentams su dviem reporteriais labai svarbu pasirinkti optimalų fluorescencinių baltymų derinį. GFP/RFP pora išlieka populiari dėl puikaus spektrinio atskyrimo, kuris sumažina signalų persidengimą vaizdavimo metu. Dėl didesnio ryškumo ir fotostabilumo daugelis tyrėjų renkasi mCherry/EGFP derinį, kuris užtikrina geresnį signalo ir triukšmo santykį sudėtingomis vaizdavimo sąlygomis. CFP/YFP pora ypač vertinga FRET taikymams arba kai reikia raudonų kanalų papildomiems žymekliams. "Cytion" optimizavo šių reporterių derinių raiškos lygius keliose savo ląstelių linijose, įskaitant HK EGFP-alfa-tubulino/H2B-mCherry ląsteles, todėl užtikrinamas nuoseklus vizualizavimas įvairiose kartose ir eksperimentinėse sąlygose.
Svarbiausi žurnalistų atrankos veiksniai
Planuodami dviejų reporterių ko-kultūrų eksperimentus, tyrėjai turi atsižvelgti į kelis pagrindinius veiksnius, turinčius įtakos reporterių veikimui. Svarbiausia yra mikroskopavimo įrangos galimybės - konfokalinėse sistemose galima naudoti įvairesnius fluoroforų derinius nei pagrindiniuose plataus lauko mikroskopuose. Eksperimento trukmė turi įtakos reporterio pasirinkimui, nes kai kurie fluorescenciniai baltymai yra labiau linkę į fotoblukimą per ilgesnius vaizdavimo seansus. Didelę reikšmę taip pat turi ląstelių modelių vidinės savybės; tam tikri ląstelių tipai pasižymi didesne autofluorescencija tam tikruose bangų ilgiuose, todėl gali užgožti reporterio signalus. Be to, skiriasi fluorescencinių baltymų jautrumas pH ir deguonies poreikis, o tai turi įtakos jų veikimui skirtingose mikroaplinkose. "Cytion" techniniai specialistai gali rekomenduoti optimalias reporterių sistemas pagal konkrečius eksperimentinius parametrus, kad būtų užtikrintas patikimas vizualizavimas atliekant ko-kultūrų tyrimus.
Dviejų reporterių sistemos, skirtos ko-kultūrų vaizdavimui
Dvigubo registratoriaus supratimas
- Atskiria skirtingas ląstelių populiacijas
- Galimybė stebėti realiuoju laiku
- Stebi ląstelių sąveiką
- Suteikia įžvalgų apie biologinius procesus
Populiarūs deriniai
- GFP/RFP: puikus atskyrimas
- mCherry/EGFP: didesnis ryškumas
- CFP/YFP: FRET taikymai
- Branduoliniai ir citoplazminiai žymekliai
Atrankos veiksniai
- Mikroskopavimo įrangos galimybės
- Eksperimento trukmė
- Ląstelių autofluorescencijos problemos
- Jautrumas aplinkai (pH, O₂)
Paruoštos naudoti dvigubo pranešėjo ląstelių linijos
Patikimų dvigubo reporterio sistemų sukūrimas gali būti techniškai sudėtingas ir reikalaujantis daug laiko, nes reikia kruopščiai optimizuoti raiškos lygius ir patvirtinti reporterio stabilumą. Šiems iššūkiams spręsti "Cytion" siūlo keletą iš anksto sukurtų ląstelių linijų su optimizuotomis dvigubo reporterio sistemomis. Mūsų HK EGFP-alfa-tubulino/H2B-mCherry ląstelės yra puikus pavyzdys, leidžiantis vienu metu itin aiškiai vizualizuoti mikrovamzdelių dinamiką (naudojant EGFP-alfa-tubuliną) ir branduolio padėtį (naudojant H2B-mCherry). Šios paruoštos naudoti ląstelės nereikalauja sudėtingų transfekcijos protokolų, klonų atrankos ir raiškos patvirtinimo, todėl gerokai pagreitina eksperimentų atlikimo laiką. Kitos optimizuotos mūsų asortimento galimybės - HK EGFP-LaminA/H2B-mCherry ląstelės branduolio apvalkalo tyrimams ir HK Mad2-LAP/H2B-mCherry ląstelės mitozės kontroliniams taškams ir chromatino dinamikai tirti.
Platus pritaikymas šiuolaikiniuose moksliniuose tyrimuose
Dviejų pranešimų sistemos buvo pritaikytos įvairiose mokslinių tyrimų srityse, nes iš esmės pakeitė mūsų supratimą apie sudėtingus biologinius procesus. Vėžio tyrimuose šios sistemos leidžia vizualizuoti naviko ir stromos sąveiką, metastazinę invaziją ir atsaką į gydymą naudojant ląstelių linijas, pavyzdžiui, NCI-H1299-EGFP ląsteles, auginamas kartu su skirtingai žymėtais stromos komponentais. Imunologai naudoja dvigubus pranešėjus, kad galėtų stebėti imuninių ląstelių įdarbinimą, aktyvavimą ir taikinių ląstelių įsitraukimą, taip suteikdami svarbių įžvalgų apie imuninę priežiūrą ir uždegimines reakcijas. Vystymosi biologai šias sistemas naudoja ląstelių likimo sprendimams stebėti, linijoms sekti ir morfogeniniams judėjimams organogenezės metu. Audinių inžinerijos srityje dvigubi pranešėjai palengvina ląstelių integracijos, diferenciacijos būsenų ir funkcinės sąveikos įvertinimą sukurtose konstrukcijose. Dvigubų reporterių metodų universalumas vis didėja, nes tyrėjai atranda naujų pritaikymo būdų naujose srityse, pavyzdžiui, organoidų technologijoje, mikrofluidinėse organų lustų platformose ir regeneracinės medicinos tyrimuose.
Nustatėme, kad esate kitoje šalyje arba naudojate kitą naršyklės kalbą nei šiuo metu pasirinkta. Ar norite priimti siūlomus nustatymus?