Cirkuliuojančių naviko ląstelių (CTC) kultūra: Iššūkiai ir nauji sprendimai

Cirkuliuojančios naviko ląstelės yra reta vėžio ląstelių populiacija, kuri atsiskyrusi nuo pirminių navikų ar metastazių vietų patenka į kraują ir yra metastazių tarpininkė bei potencialus realaus laiko informacijos apie naviką šaltinis. "Cytion" pripažįstame, kad sėkmingas CTC kultivavimas galėtų sukelti revoliuciją personalizuotoje vėžio medicinoje, nes leistų atlikti funkcinius vaistų bandymus, genomo apibūdinimą ir mechanistinius tyrimus naudojant paties paciento naviko ląsteles, gautas minimaliai invaziniu būdu paėmus kraują. Tačiau CTC auginimas kelia nepaprastų techninių sunkumų: šios ląstelės yra itin retos (dažnai mažiau nei 10 ląstelių mililitre kraujo tarp milijardų normalių kraujo ląstelių), labai nevienalytės, trapios ir linkusios prarasti izoliuojant ir auginant. Nepaisant šių kliūčių, dėl naujausių technologinių pasiekimų CTC auginimas tampa vis labiau įmanomas, o tai atveria naujas galimybes tiksliajai onkologijai.

KTK biologija ir klinikinė reikšmė

KTK patenka į kraujotaką iš pirminių navikų ir metastazių, o jų buvimas susijęs su ligos progresavimu ir prognoze daugelyje vėžio tipų. Šios ląstelės susiduria su nepalankia aplinka - šlyties stresu tekančiame kraujyje, imunine priežiūra, matrikso nepritvirtinimu - ir dauguma jų greitai žūsta. Retos išlikusios CTC pasižymi savybėmis, leidžiančiomis metastazuoti: atsparumu anoikiui (atskyrimo sukeltai ląstelių mirčiai), gebėjimu išgyventi suspensijoje ir gebėjimu ekstravazuoti bei kolonizuoti tolimus organus. CTC kultivavimas suteiktų precedento neturinčią prieigą prie šių metastazių pirmtakų ir leistų atlikti funkcinį apibūdinimą, kurio vien genominė analizė negali atskleisti. Tačiau dėl jų retumo ir trapumo CTC auginimas yra viena iš techniškai sudėtingiausių ląstelių biologijos procedūrų.

Izoliavimo technologijos: Pirmasis svarbus žingsnis

Prieš kultivuojant CTC, juos reikia atskirti nuo didžiulio normalių kraujo ląstelių pertekliaus. Taikant fizinio atskyrimo metodus išnaudojami dydžio skirtumai (KTK paprastai yra didesni už kraujo ląsteles), naudojant filtravimo arba mikrofluidinius prietaisus. Imunoafinitiniai metodai, naudojant antikūnais dengtus paviršius arba magnetinius rutuliukus, leidžia surinkti CTC, išreiškiančius epitelio žymenis, pavyzdžiui, EpCAM. Tačiau šie metodai turi trūkumų: ne visi KTK yra dideli arba išreiškia EpCAM, ypač tie, kuriuose vyksta epitelio-mezenchiminis virsmas (EMT). Neigiama deplantacija pašalina kraujo ląsteles, o CTC lieka nepaliesti, tačiau jų grynumas išlieka sudėtingas. Idealus išskyrimo metodas kultūrai turi būti švelnus, kad būtų išlaikytas gyvybingumas, ir tuo pat metu pakankamas praturtinimas ir grynumas, kad būtų išvengta kraujo ląstelių pertekliaus.

Anoikis problema

Kad išgyventų, adherentinėms ląstelėms paprastai reikia prisitvirtinti prie ekstraląstelinio matrikso; atsiskyrusios jos patiria anoikį - programuotą ląstelių mirtį. Kad išgyventų, cirkuliuojančios KTK turi įveikti anoikį, tačiau net šios atsparios ląstelės patiria didelį stresą išskiriant ir perkeliant į kultūrą. Kovos su anoikis strategijos apima skubų sodinimą ant matricomis padengtų paviršių, auginimą trimatėse matricose, kurios suteikia struktūrinę atramą, papildymą išgyvenimo veiksniais, tokiais kaip į insuliną panašūs augimo veiksniai ar EGF, arba bendrą kultūrą su palaikomosiomis maitinamosiomis ląstelėmis, kurios teikia išgyvenimo signalus. Svarbios pirmosios 24-48 valandos po išskyrimo lemia, ar KTK prisitaikys prie kultūros sąlygų, ar pasiduos atsiskyrimo sukeltai mirčiai.

Retų ląstelių proliferacijos inicijavimas

Net jei CTC išgyvena izoliaciją, proliferacijos inicijavimas iš labai mažo ląstelių skaičiaus kelia ypatingų sunkumų. Standartinė ląstelių kultūra dažnai remiasi parakrininiais signalais tarp ląstelių, tačiau kai yra tik kelios CTC, šių signalų nepakanka. Būtinų veiksnių gali suteikti kondicionuota terpė iš nustatytų vėžio ląstelių linijų arba normalių ląstelių ir ląstelių linijų. Augimo pristabdytų ląstelių maitinamieji sluoksniai tiekia parakrininius signalus nekonkuruodami dėl išteklių. Mikrobangelių matricos atskirus CTC apriboja mažais tūriais, kuriuose išskiriami veiksniai pasiekia efektyvią koncentraciją. Specializuotos terpės, optimizuotos mažo tankio kultūroms, sudėtyje yra padidintos augimo veiksnių koncentracijos ir papildomi priedai, palaikantys stresą patiriančias ląsteles. Tikslas - sukurti mikroaplinką, įveikiančią itin mažo tankio apribojimus.

Trimatės kultūros metodai

trimačių kultūrų sistemos yra ypač perspektyvios CTC plėtrai. Įterpus CTC į matriželį, kolageną ar sintetinius hidrogelius, gaunami matricos tvirtinimo taškai, kurie apsaugo nuo anoikio ir kartu leidžia organizuoti trimatę struktūrą. Organoidų auginimo metodai, kurie sėkmingai taikomi normaliems audiniams ir pirminiams navikams, taip pat gali padėti CTC augti, kai atskiri CTC suformuoja mažas į naviką panašias struktūras. Šios trimatės kultūros gali geriau išsaugoti CTC fenotipus nei tradicinės monosluoksnės, nes išlaiko ląstelių architektūrą ir signalinius kontekstus, panašesnius į in vivo navikus. Kai kuriose sistemose 3D kultūra derinama su mikrofluidine perfuzija, kad būtų tiekiamos maistinės medžiagos ir šalinamos atliekos, taip sukuriant miniatiūrinę naviko mikroaplinką, kurioje galima ilgai auginti CTC.

Maitinamųjų ląstelių sistemos

Dar viena CTC plėtimo strategija - bendra kultūra su maitinamosiomis ląstelėmis. Apšvitinti arba mitomicinu apdoroti fibroblastai, endotelio ląstelės ar net su vėžiu susiję fibroblastai teikia augimo veiksnius, matrikso baltymus ir medžiagų apykaitos palaikymą, patys nesidaugindami. Tačiau maitinimo sistemos yra sudėtingos: norint atskirti CTC nuo maitintojų, reikia atidžiai sekti, galbūt naudojant fluorescencinį žymėjimą arba skirtingą morfologiją. Galiausiai CTC turi būti atskirti nuo maitintojų, naudojant selektyvią terpę, diferencijuotą tripsinizaciją arba imunomagnetinį rūšiavimą. Nepaisant šių iššūkių, maitinimo sistemos leido sėkmingai auginti CTC, kurių būtų sunku pasiekti be maitinimo, ypač kritiniu ankstyvuoju plėtimosi etapu.

Heterogeniškumo problemos sprendimas naudojant klonų kultūrą

CTC populiacijos yra labai nevienalytės, jose yra ląstelių, turinčių skirtingą metastazinį potencialą, jautrumą vaistams ir proliferacinį pajėgumą. Mišrių KTK populiacijų auginimas dideliais kiekiais gali sudaryti sąlygas greitai augantiems klonams dominuoti ir taip prarasti įvairovę, dėl kurios KTK tampa kliniškai informatyvūs. Vienos ląstelės išskyrimas, po kurio atliekama klonų ekspansija, išsaugo šį heterogeniškumą ir leidžia apibūdinti atskiras CTC subpopuliacijas. Mikromanipuliacija, fluorescencija aktyvuotas ląstelių rūšiavimas (FACS) arba mikrofluidinis vienos ląstelės dozavimas gali atskirti atskirus KTK į atskirus šulinėlius. Nors šis metodas yra techniškai sudėtingas ir reikalauja kantrybės, nes pavienės ląstelės lėtai formuoja klonus, jis atskleidžia tikrąją paciento CTC populiacijos įvairovę ir nustato subpopuliacijas, pasižyminčias skirtingomis funkcinėmis savybėmis.

Žiniasklaidos optimizavimas CTC augimui

Universalios CTC auginimo terpės nėra, nes skirtingų tipų vėžio ir pacientų CTC turi skirtingus reikalavimus. Daugelis grupių pradeda nuo terpės, optimizuotos panašios kilmės vėžio ląstelių linijoms (pvz., RPMI - krūties vėžio CTC, DMEM - plaučių vėžio CTC), tada ją papildo papildomais augimo veiksniais, įskaitant EGF, FGF, insuliną ir kt. Į kai kuriuos protokolus įtraukiami kamieninių ląstelių terpės komponentai, pavyzdžiui, B27 arba N2 papildai, darant prielaidą, kad į kamienines ląsteles panašiems CTC gali reikėti panašios paramos. Serumo koncentracija yra dar vienas kintamasis: kai kuriuose protokoluose naudojama daug serumo (15-20 %), kad būtų maksimaliai palaikomas augimas, o kituose - apibrėžti preparatai be serumo, kad būtų galima geriau kontroliuoti. Gali prireikti empirinio optimizavimo kiekvienam paciento mėginiui, nors tai sudėtinga, atsižvelgiant į ribotą pradinę medžiagą.

Stebėsena ir apibūdinimas plėtimosi metu

Plečiantis KTK kultūroms, nuolatinė stebėsena užtikrina, kad kultivuojamos ląstelės išlaikytų KTK savybes ir nebūtų peraugusios teršalais. Imunoženklinimas epitelio žymenimis (citokeratinais, EpCAM), vėžio žymenimis, atitinkančiais naviko tipą (ER/PR krūties atveju, PSA prostatos atveju), ir leukocitų žymenų (CD45) nebuvimas patvirtina tapatybę. Genetinis charakterizavimas naudojant trumpų tandeminių pasikartojimų (STR) profiliavimą, kariotipavimą arba tikslinį sekos nustatymą patvirtina, kad išaugintos ląstelės atitinka paciento naviko genotipą. Funkciniai tyrimai, kuriais vertinamos navikinės savybės, atsakas į vaistus ar invazijos gebėjimas, rodo, kad kultivuojamos KTK išlaiko biologiškai svarbius fenotipus. Šis nuolatinis apibūdinimas yra labai svarbus, nes klinikinių sprendimų, priimamų remiantis KTK kultūromis, rizika yra didelė.

Sėkmės rodikliai ir prognozavimo veiksniai

KTK kultūrų sėkmės rodikliai išlieka nedideli, paprastai 1-10 % bandymų, nors jie labai skiriasi priklausomai nuo vėžio tipo, ligos stadijos ir metodikos. Metastazavusiems pacientams, kuriems nustatytas didelis KTK skaičius, sėkmės rodikliai yra geresni nei tiems, kuriems KTK yra nedaug. Tam tikrų tipų vėžys yra lengviau kultivuojamas - krūties, prostatos ir smulkialąstelinio plaučių vėžio KTK kultivuojami dažniau nei kitų tipų vėžio KTK. Techniniai veiksniai taip pat svarbūs: švelnesni išskyrimo metodai, greitas apdorojimas, optimizuotos auginimo sąlygos ir patyrę operatoriai - visa tai pagerina rezultatus. Tobulėjant šiai sričiai ir standartizuojant metodus, sėkmės rodikliai turėtų gerėti, tačiau CTC kultivavimas greičiausiai ir toliau bus sudėtingas, nes šios ląstelės iš esmės yra stresinės būklės.

CTC išvestų eksplantų modeliai

Alternatyva tradicinei in vitro kultūrai yra CTC išvestų eksplantų (CDX) modeliai, kai CTC suleidžiami į imunodeficitines peles, kad galėtų plėstis in vivo. Gyvūnų mikroaplinka suteikia augimo veiksnius, matricą ir trimatę struktūrą, kurie gali geriau palaikyti CTC išgyvenamumą nei dirbtinės kultūros sąlygos. Įsitvirtinę kaip navikai pelėse, jie gali būti surenkami ir iš naujo kultivuojami in vitro arba serijiniu būdu perduodami gyvūnams. Nors taikant šį metodą išvengiama kai kurių auginimo problemų, tačiau atsiranda ir kitų: išlaidos, laikas, gyvūnų patalpų reikalavimai ir galimas pelių aplinkos atrankos spaudimas, kuris gali pakeisti KTK savybes. Nepaisant to, CDX modeliai pasirodė esantys vertingi, kai tiesioginis auginimas nepasiteisina, nes jais galima gauti išplėstinės medžiagos tolesniems taikymams.

Taikymas tiksliojoje onkologijoje

Galutinis KTK kultūrų tikslas - sudaryti sąlygas taikyti tiksliąją mediciną. Funkciniai vaistų tyrimai su paciento kultivuotais CTC galėtų padėti parinkti gydymą, nustatyti veiksmingus gydymo būdus ir išvengti nenaudingo toksinio gydymo. Kadangi CTC atspindi naviko biologiją realiuoju laiku, jie gali geriau atspindėti dabartinį jautrumą vaistams nei archyvuoti pirminiai naviko mėginiai, paimti prieš daugelį metų. Kultivuotų CTCs mechanistiniai tyrimai gali atskleisti atsparumo mechanizmus, metastazių savybes ir naujus terapinius taikinius. Iš CTC kultūrų gautų ląstelių biobankos sukuria pacientams tinkamų vėžio modelių saugyklas, skirtas moksliniams tyrimams. Tačiau norint įgyvendinti šias programas, reikia įveikti dabartinius techninius apribojimus ir patvirtinti, kad išauginti KTK tiksliai atspindi paciento ligą.

Mikrofluidinės KTK kultūros platformos

Mikrofluidiniai prietaisai turi unikalių pranašumų CTC auginimui, nes leidžia tiksliai kontroliuoti mikroaplinką, atitinkančią pavienių ląstelių ar mažų klasterių mastą. Šiose platformose galima sukurti maistinių medžiagų gradientus, užtikrinti tikslią veiksnių koncentraciją, palaikyti laminarinį srautą, kad būtų galima nuolat keistis maistinėmis medžiagomis, ir įmontuoti biojutiklius, kad būtų galima stebėti realiuoju laiku. Kai kurie prietaisai sujungia paėmimą ir auginimą į vieną sistemą, taip sumažindami ląstelių praradimą perkėlimo metu. Su vaizdu suderinami prietaisai leidžia nuolat stebėti CTC elgseną, proliferaciją ir morfologiją. Nors mikrofluidiniai metodai yra labai perspektyvūs, jiems reikia specializuotos įrangos ir žinių, o tai riboja jų platų taikymą. Kai šios technologijos ištobulės ir taps prieinamesnės, jos gali tapti standartinėmis KTK auginimo priemonėmis.

Kokybės kontrolė ir taršos prevencija

Atsižvelgiant į tai, kad KTK yra itin reti, kraujo ląstelės ar kitų tipų ląstelės gali lengvai užteršti kultūras. Labai svarbu taikyti griežtą sterilią techniką ir anksti aptikti užteršimą. Reguliariai atliekant mikroskopinį tyrimą nustatomi morfologiškai skirtingi teršalai. Srauto citometrija arba imunoženklinimas pagal linijinius žymenis (CD45 - leukocitai, CD31 - endotelio ląstelės) padeda aptikti neepitelines ląsteles. Jei užterštumas pastebimas anksti, selektyvioji terpė arba imunomagnetinis pašalinimas gali išgelbėti kultūrą. Geriau užkirsti kelią, nei gydyti: kraujo ląstelių imunodeplecija prieš kultūrą, selektyvios terpės ir klonų gryninimas išskiriant pavienes ląsteles - visa tai sumažina užteršimo riziką. Šios griežtos kokybės priemonės padidina sudėtingumą, tačiau yra būtinos atsižvelgiant į tai, kad KTK mėginiai yra brangūs.

Standartizuotų ląstelių linijų vaidmuo

Nors CTC kultūroje daugiausia dėmesio skiriama pacientų mėginiams, svarbų pagalbinį vaidmenį atlieka standartizuotos ląstelės ir ląstelių linijos iš "Cytion". Nustatytos vėžio linijos yra teigiama izoliavimo technologijų kontrolė, leidžianti patvirtinti ir optimizuoti metodus prieš juos taikant brangiems pacientų mėginiams. Jos teikia kondicionuotą terpę CTC kultūrų palaikymui. Sumaišytos su kraujo mėginiais, jos sukuria dirbtinius CTC mėginius, skirtus metodų kūrimui ir mokymui. Kai kurie tyrėjai naudoja sukurtas linijas kaip pakaitinius modelius, kad išbandytų kultivavimo sąlygas ar terpės formules, kurios gali būti naudingos tikriesiems CTC. Nors šios standartizuotos priemonės nepakeičia pacientų CTC, jos pagreitina metodų kūrimą ir užtikrina kokybės kontrolę visoje darbo eigoje.

Naujos technologijos ir ateities kryptys

Keletas naujų metodų gali pagerinti KTK auginimo sėkmę. Organų lustų sistemos, apimančios kelių tipų ląsteles, išsamiau modeliuoja naviko mikroaplinką. Kontroliuojamą perfuziją užtikrinantys bioreaktoriai padeda ilgai auginti nedidelius ląstelių kiekius. Pažangios biomedžiagos, pasižyminčios reguliuojamomis mechaninėmis ir biocheminėmis savybėmis, optimizuoja fizinę kultūros aplinką. Ankstyvųjų kultūros parametrų mašininio mokymosi analizė gali padėti numatyti sėkmingą plėtrą, todėl išteklius galima sutelkti į perspektyvius mėginius. Vienos ląstelės daugiakomponentinis charakterizavimas prieš kultūrą galėtų leisti atrinkti labiausiai tikėtinas augti CTC. CRISPR pagrįsta inžinerija galėtų padidinti CTC išgyvenamumą nesumažinant klinikinės svarbos. Šioms technologijoms susiliečiant, CTC kultūros turėtų tapti įprastesnėmis ir pagaliau įgyvendinti savo pažadą dėl tiksliosios vėžio medicinos.