CRISPR atranka ląstelių linijose: Funkcinė genomo analizė

CRISPR-Cas9 technologija sukėlė revoliuciją funkcinėje genomikoje, leisdama sistemingai ištirti genų funkcijas visuose genomuose kultivuojamose ląstelėse. "Cytion" pripažįstame, kad mūsų ląstelės ir ląstelių linijos yra galingos CRISPR atrankinės patikros programos, kuriose nustatomi genai, kontroliuojantys įvairius ląstelių procesus - nuo proliferacijos iki atsparumo vaistams. Į ląstelių populiacijas įvedamos bibliotekos, kuriose yra nuo tūkstančių iki šimtų tūkstančių vedančiųjų RNR (sgRNA), taip sukuriant didžiules kolekcijas, kuriose kiekviena ląstelė gauna skirtingą genetinį trikdį. Taikydami atrankinį spaudimą ir stebėdami, kurios sgRNA praturtėja ar išnyksta, tyrėjai sistemingai nustato genus, būtinus išgyvenimui, genus, suteikiančius atsparumą vaistams, arba genus, reguliuojančius bet kokį pasirenkamą fenotipą. Šis nešališkas funkcinės genomikos metodas paspartino atradimus vėžio biologijos, imunologijos, infekcinių ligų ir fundamentaliosios ląstelių biologijos srityse, paversdamas kultivuotas ląsteles sistemingų biologinių atradimų varikliais.

CRISPR bibliotekos kūrimas ir pristatymas

Genomo masto CRISPR bibliotekose yra sgRNA sekų, nukreiptų į visus genomo baltymus koduojančius genus, paprastai su 4-10 vedlių kiekvienam genui, kad būtų užtikrinta patikima aprėptis ir atsižvelgta į kintantį vedlių efektyvumą. Žmogaus genomo bibliotekose yra 70 000-100 000 sgRNA sekų, o tikslinės bibliotekos, skirtos tokiems pogrupiams kaip kinazės, epigenetiniai reguliatoriai ar medžiagų apykaitos fermentai, leidžia užtikrinti didesnę aprėptį, naudojant mažiau konstrukcijų. Bibliotekos kokybė turi lemiamą įtaką atrankos sėkmei - vedliai turi efektyviai sukelti nokautą ir kartu išvengti netikslinio poveikio, kuris trukdo interpretacijai.

Lentivirusinis pristatymas tebėra standartas sgRNA bibliotekoms įvesti į ląstelių populiacijas. Surinktais lentivirusais, kuriuose yra visa sgRNA biblioteka, ląstelės užkrečiamos nedideliu infekcijos dažniu (MOI), paprastai 0,3-0,5, todėl dauguma užkrėstų ląstelių gauna tik vieną sgRNA konstruktą. Šis vienos perturbacijos vienai ląstelei reikalavimas apsaugo nuo klaidinančių veiksnių, susijusių su ląstelėmis, turinčiomis daugybę išstūmimų. Po transdukcijos antibiotikų atranka pašalinamos neužkrėstos ląstelės, todėl gaunamos populiacijos, kuriose kiekviena ląstelė turi apibrėžtą genetinį pakitimą. Cytion ląstelių linijų transdukcijos efektyvumas skiriasi priklausomai nuo ląstelių tipo - suspensinės ląstelės dažnai transdukuojamos efektyviai, o kai kurioms adherentinėms linijoms reikia optimizuoti viruso koncentraciją, polibreno kiekį ir spinokuliaciją.

Bibliotekos pateikimas - ląstelių, kuriose yra kiekviena sgRNA, skaičius - turi lemiamos įtakos ekrano kokybei. Norint išvengti stochastinio vadovų praradimo dėl atsitiktinio atrankos poveikio, reikia išlaikyti 500-1000 ląstelių kiekvienai sgRNA viso eksperimento metu. Norint sukurti 100 000 sgRNA biblioteką, reikia pradėti nuo 50-100 milijonų ląstelių populiacijos ir palaikyti proporcingą jų skaičių per atranką ir perleidimą. Nepakankamas atstovavimas sukelia triukšmą, kuris užgožia tikruosius pataikymus ir sukelia klaidingai teigiamus rezultatus dėl atsitiktinio iškritimo.

Neigiamos atrankos atranka: Esminių genų nustatymas

Neigiamos atrankos atrankos ekranais nustatomi genai, reikalingi ląstelių išgyvenimui ar dauginimuisi standartinėmis kultūros sąlygomis. Ląstelės transdukuojamos sgRNA bibliotekomis, atrenkamos integracijai, tada 2-4 savaites nepertraukiamai pasuojamos, išlaikant bibliotekos reprezentaciją. sgRNA, nukreiptos į esminius genus, išsenka, nes ląstelės, kuriose yra šių nukautų genų, nesidaugina arba miršta. Lyginant sgRNA gausumą galutiniame laiko taške su pradine populiacija (T0), paaiškėja, kurie genai yra būtini tinkamumui eksperimentinėmis sąlygomis.

Esminių genų ekranai sukuria specifinės ląstelių linijos priklausomybės žemėlapius, atskleidžiančius pažeidžiamumą, kurį galima išnaudoti terapinei intervencijai. Vėžinių ląstelių linijos dažnai priklauso nuo onkogenų arba kelio komponentų, kurie nereikalingi normalioms ląstelėms, ir tai yra potencialūs terapiniai taikiniai. Pavyzdžiui, HeLa ląstelėms būdinga priklausomybė nuo genų, palaikančių greitą proliferaciją ir genomo nestabilumo valdymą. Vykdant projektą "Vėžio priklausomybės žemėlapis" atlikti genomo CRISPR tyrimai šimtuose vėžinių ląstelių linijų, katalogizuotos genetinės priklausomybės ir susietos su genominėmis savybėmis, kad būtų galima numatyti pacientui būdingą pažeidžiamumą.

Kontekstui būdingi esmingumo ekranai palygina genų priklausomybę skirtingose sąlygose ar ląstelių linijose. Atliekant lygiagrečius normalių ir transformuotų ląstelių arba skirtingos genetinės kilmės ląstelių tyrimus, nustatomos sintetinės mirtinos sąveikos, kai genų praradimas yra mirtinas tik tam tikromis aplinkybėmis. Šios kontekstui būdingos priklausomybės suteikia terapinius langus - genų, kurie yra būtini vėžiui, bet nereikalingi normaliems audiniams, nukreipimas sumažina toksiškumą. Lyginamoji CRISPR atranka leidžia nustatyti ląstelių priklausomybių genetinę struktūrą, naudojant Cytion ląstelių linijas, atstovaujančias įvairioms audinių kilmėms ir transformacijos būsenoms.

Teigiamos atrankos tyrimai: Atsparumo ir išlikimo mechanizmai

Pozityviosios atrankos ekranuose taikomas atrankinis spaudimas, kuris sunaikina didžiąją dalį ląstelių, taip praturtinant sgRNA, suteikiančias išlikimo arba atsparumo savybes. Atsparumo vaistams atrankiniai tyrimai bibliotekos užkrėstoms ląstelėms taikomos terapijos priemonės, kurių koncentracija žudo nemodifikuotas ląsteles. Išgyvenusios ląstelės praturtinamos sgRNA, suardančiomis vaistų taikinius, aktyvuojančiomis atsparumo kelius arba blokuojančiomis proapoptozinį signalą. Nustatant šiuos genus atskleidžiami vaistų veikimo mechanizmai ir galimi atsparumo mechanizmai, kurie gali pasireikšti klinikoje.

Atsparumo toksinams ekranai leidžia nustatyti genus, reikalingus toksinų įsisavinimui, aktyvinimui ar tolesniam citotoksiškumui. Pavyzdžiui, tikrinant difterijos toksiną išskiriamos sgRNA, nukreiptos į toksino receptorių ir toksino patekimui į membraną reikalingus membranos judėjimo komponentus. Atliekant jautrumo patogenams tyrimus ląstelės veikiamos virusais arba bakterijų toksinais ir nustatomi infekcijai būtini šeimininko veiksniai. Šiais atrankiniais tyrimais nustatomi ląstelių mechanizmai, kuriuos naudoja patogenai, ir atskleidžiami galimi terapiniai taikiniai infekcijai blokuoti.

Nepriklausomybės nuo augimo veiksnių ekranuose ląstelės auginamos esant sumažintam serumo kiekiui arba atsisakius tam tikrų augimo veiksnių, nustatant genus, kurių sutrikimas leidžia daugintis nepriklausomai nuo augimo veiksnių. Šie pataikymai dažnai yra naviko slopintojai arba neigiami augimo signalų kelių reguliatoriai. Supratus augimo veiksnių nepriklausomybę užtikrinančius kelius, išryškėja vėžio progresavimo mechanizmai ir nustatomi galimi taikiniai kombinuotiems gydymo būdams, kurie užkerta kelią atsparumo atsiradimui.

FACS pagrįsti CRISPR tyrimai

Fluorescencija aktyvuotas ląstelių rūšiavimas leidžia atlikti genų, reguliuojančių bet kokį fluorescenciniu būdu išmatuojamą fenotipą, atranką. Ląstelės, išreiškiančios fluorescencinį reporterį, kontroliuojamą dominančio kelio, transdukuojamos sgRNA bibliotekomis, tada rūšiuojamos pagal reporterio raišką. Ląstelės su didele ir maža reporterio raiška surenkamos atskirai, o sgRNA kiekis populiacijose palyginamas. Praturtintos sgRNA identifikuoja teigiamus reguliatorius (jų padaugėja mažos raiškos populiacijoje, kai jos išstumiamos) ir neigiamus reguliatorius (jų padaugėja didelės raiškos populiacijoje, kai jos išstumiamos).

Paviršiaus žymenų ekranai surūšiuoja ląsteles pagal antikūnų dažymą ląstelių paviršiaus baltymais. Šie ekranai padeda nustatyti antigeno pateikimo, imuninių kontrolinių taškų ligandų arba sukibimo molekulių reguliatorius. Rengiant imunoterapiją, FACS pagrįstuose ekranuose nustatyti genai, kontroliuojantys PD-L1 raišką, atskleidžiant taikinius, kurie galėtų sustiprinti atsaką į imunoterapiją. Galimybė rūšiuoti pagal endogeninę baltymų raišką, o ne pagal inžinerinius reporterius, išplečia ekrano taikymo sritį iki bet kokio baltymo su tinkamais antikūnais.

Daugiaparametrinė FACS leidžia atlikti sudėtingą fenotipinę diskriminaciją. Vienu metu matuojant kelis žymenis, galima nustatyti genus, kurie konkrečiai veikia tam tikras ląstelių populiacijas ar būsenas. Pavyzdžiui, rūšiavimas pagal dydį ir granuliometrinę sudėtį kartu su gyvybingumo dažais atskiria apoptozines ląsteles nuo sveikų, todėl galima atlikti apoptozės reguliatorių atranką. Pagrindinis apribojimas išlieka našumas - FACS grindžiamiems ekranams reikia daugiau ląstelių nei paprastiems išlikimo atrankos metodams, be to, yra praktinių apribojimų, kiek ląstelių galima surūšiuoti, todėl gali būti ribojamas bibliotekos dydis arba atstovavimas.

Vaizdais pagrįsti CRISPR tyrimai

Automatinė mikroskopija kartu su vaizdų analize leidžia atlikti morfologinių fenotipų, kurie nepasiekiami naudojant FACS, atranką. Ląstelės, užkrėstos surikiuotomis sgRNA bibliotekomis (vienas arba keli vedliai viename šulinyje), fiksuojamos ir vaizduojamos, išskiriant šimtus morfologinių požymių kiekvienoje ląstelėje. Mašininis mokymasis klasifikuoja fenotipus, nustatydamas būdinguosius morfologinius pokyčius sukeliančius gidus. Skirtingai nei grupiniuose ekranuose, matriciniuose formatuose išlaikomas erdvinis trikdžių atskyrimas, todėl galima atlikti mikroskopija pagrįstus matavimus.

Organelės morfologijos ekranuose nustatomi genai, reguliuojantys mitochondrijų tinklus, Golgio struktūrą, branduolio morfologiją arba citoskeleto organizaciją. Šie ekranai atskleidė kokybės kontrolės mechanizmus, palaikančius organelės funkciją, ir nustatė genus, koordinuojančius organelės dinamiką su ląstelės ciklo eiga. Cytion ląstelių linijų, turinčių gerai apibūdintą morfologiją, vaizdų pagrindu atliekami tyrimai gali nustatyti subtilius fenotipus, nematomus kitais rodmenimis.

Gyvos ląstelės vaizdavimo ekranai stebi dinamiškus procesus, tokius kaip ląstelių dalijimasis, migracija ar kalcio signalų perdavimas. Laiko trukmės vaizdavimas, naudojant išstumtų ląstelių matricas, atskleidžia genus, kontroliuojančius dalijimosi laiką, mitozės verpstės orientaciją arba migracijos greitį ir kryptį. Turtingi vaizdavimo duomenys yra gaunami našumo sąskaita, nes per matricinius ekranus tiriama mažiau trikdžių nei per jungtinius ekranus, nors tikslinės bibliotekos, skirtos konkrečioms genų šeimoms, suderina aprėptį su praktiniais apribojimais.

Analizė ir pataikymo patvirtinimas

Po atrankos ir mėginių surinkimo išskiriama genominė DNR, o sgRNA regionas padauginamas PGR naudojant pradmenis, įskaitant sekoskaitos adapterius. Giluminis sekoskaitos nustatymas kiekybiškai įvertina kiekvieno sgRNA kiekį, generuojant eksperimentinių ir kontrolinių mėginių skaitinių skaičių palyginimą. Kompiuterinės priemonės, tokios kaip MAGeCK, BAGEL ar JACKS, statistiškai įvertina praturtinimą ar išstūmimą, atsižvelgiant į daugelio hipotezių tikrinimą tūkstančiuose genų.

Didelio patikimumo pataikymai rodo nuoseklų poveikį kelioms nepriklausomoms sgRNA, nukreiptoms į tą patį geną. Genai, kurių poveikį rodo tik vienas ar du gidai, greičiausiai yra netiksliniai artefaktai, o ne tikri pataikymai. Statistiniais metodais apibendrinami kiekvieno geno gidų įrodymai, taip padidinama galia aptikti tikrus teigiamus rezultatus ir sumažinama klaidingų atradimų dėl atskirų gidų netikslumų. Kontroliniai kreipiniai, nukreipti į žinomus esminius genus arba į netikslinius kontrolinius genus, patvirtina ekrano efektyvumą ir kalibruoja statistines ribas.

Patvirtinimo eksperimentai patvirtina atrankos atitiktį naudojant nepriklausomas sgRNA arba ortogonalius išstūmimo metodus. Atskiros sgRNA klonuojamos ir išbandomos su atrankine ląstelių linija ir, idealiu atveju, su kitomis ląstelių linijomis, kad būtų galima įvertinti atkuriamumą ir apibendrinamumą. Gelbėjimo eksperimentai, kurių metu tikslinis genas iš naujo išreiškiamas iš cDNA, neturinčios sgRNA tikslinės sekos, patvirtina tikslinį poveikį. Siekiant patvirtinti terapinį taikinį, testuojant pataikymus įvairioms genetinėms linijoms priklausančių Cytion ląstelių linijų grupėse, nustatomos plačiai taikytinos priklausomybės, palyginti su specifinėmis priklausomybėmis nuo konteksto.

Variantai ir pažangūs atrankinės patikros metodai

CRISPRi ir CRISPRa ekranuose naudojamas kataliziškai neaktyvus Cas9, sujungtas su transkripcijos represoriais arba aktyvatoriais, todėl galima grįžtamai nukauti arba aktyvuoti geną, o ne nuolatos jį išjungti. Taikant šiuos metodus išvengiama sumaišties dėl visiško geno praradimo, modeliuojami genų raiškos pokyčiai, o ne nulinės mutacijos, ir galima patikrinti baltymo nekoduojančius reguliavimo elementus. Esminiams genams, kurių išstūmimas sukelia mirtingumą, CRISPRi dalinis išstūmimas gali atskleisti nuo dozės priklausomus fenotipus ir terapinius langus.

Bazės redaktoriaus ekranuose įvedamos tikslios taškinės mutacijos, o ne įterpimai ir (arba) išbraukimai, todėl galima sistemingai mutagenezuoti baltymų domenus arba reguliavimo elementus. Pirminio redagavimo ekranai gali būti dar tikslesni, nes juose įvedamos arba ištaisomos konkrečios mutacijos. Šie naujos kartos ekranai leis sistemingai ištirti baltymų struktūros ir funkcijos sąsajas ir ištirti su ligomis susijusius variantus dideliu mastu.

Kombinuoti ekranai, kuriuose naudojamos dvigubos sgRNA bibliotekos, sistemingai tikrina genų poras, nustatant genetines sąveikas, įskaitant sintetinį mirtingumą, slopinimą ir epistazę. Nors tai techniškai sudėtinga dėl faktorinio bibliotekos sudėtingumo didinimo, kombinuotieji ekranai sudaro genetinių tinklų žemėlapius ir nustato kombinuotas gydymo strategijas. Tiksliniai kombinaciniai ekranai, nukreipti į vaistams tinkamų genų poras, atskleidžia kombinuotus gydymo būdus, kurie galėtų užkirsti kelią atsparumui arba padidinti veiksmingumą, palyginti su vienkartiniu gydymu.

Vaistų atradimo ir kūrimo taikymas

CRISPR ekranai pagreitina taikinių nustatymą, sistemingai tikrinant, kurie genai, juos pažeidus, sukelia norimus terapinius fenotipus. Vėžio priklausomybės ekranuose nustatomi vėžio ląstelėse ypač svarbūs genai, kurie yra potencialūs terapiniai taikiniai. Tyrimai su pacientų ląstelėmis arba izogeninių ląstelių linijų grupėmis stratifikuoja taikinius pagal genetinį kontekstą, todėl galima taikyti tiksliosios medicinos metodus, pagal kuriuos terapija derinama su paciento biomarkeriais.

Atliekant nežinomų taikinių turinčių junginių veikimo mechanizmo tyrimus, CRISPR ekranais nustatomi atsparumą ar jautrumą lemiantys genai. Jei konkretaus geno sutrikdymas sukelia atsparumą junginiui, tikėtina, kad tas genas koduoja taikinį arba kelio komponentą, būtiną vaisto veikimui. Taikant šį metodą buvo išaiškinti tiek jau žinomų, tiek naujų vaistų veikimo mechanizmai, pagreitintas klinikinis vystymasis ir nustatyti biomarkeriai pacientų atrankai.

Atliekant CRISPR atranką atsparumo mechanizmo prognozavimo ekranus ląstelės apdorojamos nelemtomis vaisto dozėmis ir nustatomi genai, kurių pažeidimas lemia atsparumą. Šie genai yra potencialūs mechanizmai, kuriais navikas gali išvengti gydymo, todėl galima kurti atsparumo kelius blokuojančias kombinuotas strategijas. Atliekant "Cytion" ląstelių linijų, modeliuojančių įvairius vėžio tipus, atsparumo patikrą gaunama informacijos apie klinikinių tyrimų planavimą ir pacientų stebėsenos strategijas.

Iššūkiai ir geroji patirtis

Nepaisant patobulintų sgRNA projektavimo algoritmų, vis dar kyla problemų dėl netikslinio poveikio. Kai kurie vadovai skelia nenumatytas genomo vietas, kurių seka panaši į tikslinę, todėl gali sukelti fenotipus, nesusijusius su numatytu genų pažeidimu. Naudojant kelis nepriklausomus kreipinius vienam genui ir statistinį kreipinių apibendrinimą, ši problema sušvelninama. Geriausių pataikymų patvirtinimas ortogoniniais metodais patvirtina, kad poveikis yra tikslinis.

Nepilna arba vėluojanti nokauto kinetika gali turėti įtakos atrankos rezultatams. Kai kurios sgRNA kerpa neefektyviai, todėl iš dalies išstumiamos, o ne visiškai išstumiamos. Baltymų stabilumas reiškia, kad DNR ir (arba) RNR lygio nokautui reikia laiko, kad esamas baltymas suirtų, kol pasireikš fenotipai. Tyrimai turi trukti pakankamai ilgai po atrankos, kad baltymas visiškai išsivalytų, paprastai 7-14 dienų, priklausomai nuo tikslinio baltymo pusinės eliminacijos laiko ir ląstelių padvigubėjimo laiko.

Ekranų kokybės kontrolė apima bibliotekos atstovavimo stebėseną, Cas9 aktyvumo patvirtinimą ir kontrolinių vadovų tikėtinos elgsenos patvirtinimą. Pradinių populiacijų sekvenavimas patvirtina bibliotekos sudėtingumą ir atstovavimą. Vadovai, nukreipti į žinomus esminius genus, neigiamos atrankos ekranuose turėtų pasižymėti dideliu išnykimu, o netiksliniai kontroliniai genai neturėtų smarkiai pasikeisti. Nukrypimas nuo tikėtinos kontrolės elgsenos rodo technines problemas, kurias reikia pašalinti prieš interpretuojant eksperimentų rezultatus.

Ateities kryptys ir taikomųjų programų plėtra

Perturb-seq sujungia CRISPR atranką su vienos ląstelės RNR sekos nustatymu, vienu metu nustatant transkriptomų atsaką į tūkstančius genetinių trikdžių. Taikant šį metodą nustatomas genų sutrikimų plitimas molekuliniuose tinkluose, atskleidžiami reguliaciniai ryšiai ir kelių struktūra. "Cytion" ląstelių linijų atveju "Perturb-seq" duomenų rinkiniai suteikia išsamų funkcinį apibūdinimą, papildantį tradicinius atrankinės patikros metodus.

In vivo CRISPR atrankinė patikra išplečia jungtinę atrankinę patikrą į gyvūnų modelius, nustatant genus, kontroliuojančius naviko augimą, metastazes ar atsaką į imunoterapiją fiziologiškai svarbiomis aplinkybėmis. Bibliotekomis užkrėstos ląstelės implantuojamos pelėms, o augliai surenkami sgRNA kiekybiniam įvertinimui. Augančiuose navikuose esantys genai yra in vivo tinkamumo veiksniai, kurie gali būti nepastebėti atliekant ląstelių kultūrų atranką. Šie metodai yra tarpinė grandis tarp ląstelių linijų tyrimų ir klinikinio pritaikymo.

"Cytion" ir ląstelių kultūrų bendruomenės nuomone, CRISPR atranka ląstelės linijas iš pasyvių eksperimentinių modelių pavertė aktyviais atradimų varikliais. Sisteminga funkcinė apklausa, kurią įgalina genomo atrankinė patikra, ir toliau atskleidžia fundamentalias biologijos ir gydymo galimybes, įtvirtindama kultūrines ląsteles kaip nepakeičiamas šiuolaikinių biologinių tyrimų ir vaistų kūrimo priemones.