Bioprintingas su ląstelių linijomis: Nuo 2D iki 3D atspausdintų audinių konstrukcijų

Trimatis biografijos spausdinimas - tai revoliucinė technologija, leidžianti tiksliai erdviškai nusodinti gyvas ląsteles, biomedžiagas ir biologiškai aktyvias molekules, kad būtų galima pagaminti apibrėžtos architektūros audinių konstrukcijas, atkartojančias natūralią audinių organizaciją. "Cytion" pripažįstame, kad sukurtos ląstelių linijos, palyginti su pirminėmis ląstelėmis, turi didelių privalumų biotinklaraščių spausdinimui, įskaitant neribotą plėtrą, gerai apibūdintą elgseną, pastovią kokybę ir mažesnius etinius apribojimus. Pereinant nuo tradicinių dvimačių viensluoksnių kultūrų prie trimačių bioprintinių konstrukcijų, kuriose naudojamos ląstelės ir ląstelių linijos, reikia atidžiai apsvarstyti biologinio rašalo sudėtį, spausdinimo metodiką, ląstelių reakciją į mechaninį poveikį nusodinimo metu ir brandinimo po spausdinimo protokolus. Šis pažangus gamybos metodas leidžia gaminti sudėtingus audinių modelius, skirtus vaistų atrankai, ligų modeliavimui ir fundamentiniams biologiniams tyrimams, beprecedentiškai kontroliuojant ląstelių sudėtį, erdvinę organizaciją ir mikroarchitektūros ypatybes.

Biologinio rašalo sudėtis ir reologinės savybės

Biologinio rašalo sudėtis yra svarbiausias veiksnys, lemiantis bioprinto sėkmę, nes reikia kruopščiai derinti spausdinimo savybes, ląstelių suderinamumą ir struktūrinį vientisumą po spausdinimo. Idealūs bioinksai pasižymi šlyties plonėjimo savybėmis, kai klampumas mažėja veikiant šlyties įtempiui ekstruzijos metu, o po nusodinimo greitai atsistato, kad būtų išlaikytas atspausdintos struktūros ištikimumas. Priklausomai nuo spausdinimo metodikos, klampumas paprastai svyruoja nuo 30 iki 6×10⁷ mPa-s, o ekstruzijos būdu sukurtoms sistemoms, kad išlaikytų formą, reikia didesnio klampumo (≥1000 mPa-s), palyginti su rašalinio purkštuko metodais, kuriems reikia mažo klampumo (3-12 mPa-s), kad susidarytų lašeliai. Ląstelių koncentracija biologiniuose rašaluose paprastai svyruoja nuo 1×10⁶ iki 2×10⁷ ląstelių viename mililitre, taip užtikrinant pusiausvyrą tarp pakankamo ląstelių tankio audiniams formuoti ir galimo spausdinimo purkštukų užsikimšimo bei per didelio medžiagos klampumo. Įprastos biologinio rašalo pagrindo medžiagos yra alginatas, želatina, želatinos metakrilatas (GelMA), hialurono rūgštis ir agarozė, dažnai derinamos į daugiakomponentes formules, siekiant optimizuoti mechanines savybes, skilimo kinetiką ir biologinį aktyvumą. Cytiono ląstelėms ir ląstelių linijoms labai svarbus empirinis biologinio rašalo sudėties optimizavimas, kad būtų atsižvelgta į ląstelių tipui būdingus sukibimo reikalavimus ir jautrumą mechaniniam poveikiui spausdinant.

Ekstruzijos būdu sukurtos biospausdinimo sistemos

Ekstruzijos būdu grindžiamas biografijos spausdinimas yra plačiausiai paplitusi technologija dėl palyginti nedidelių įrangos sąnaudų, suderinamumo su didelio klampumo biologiniais rašalais ir didelio ląstelių tankio bei galimybės gaminti centimetrinio dydžio konstrukcijas. Šiomis sistemomis per 100-500 mikrometrų skersmens cilindrinius purkštukus išpurškiamos nepertraukiamos ląstelių prisotintos medžiagos gijos, o nusodinimas valdomas pneumatiniu slėgiu, mechaniniu sraigtu varomu poslinkiu arba stūmokliu. Pagrindinė problema yra šlyties įtempiai, kuriuos ląstelės patiria išspaudimo iš purkštukų metu, o jų dydis priklauso nuo purkštuko skersmens, taikomo slėgio ir biologinio rašalo klampumo pagal skysčių mechanikos principus. Didžiausią šlyties įtempį ląstelės patiria ties purkštuko sienele, dėl kurio gali būti pažeistos membranos, sumažėti gyvybingumas ir pakisti genų raiškos profiliai, jei šis įtempis yra per didelis. Optimizuojant reikia subalansuoti purkštuko skersmenį ir ekstruzijos slėgį, kad būtų pasiekta pageidaujama skiriamoji geba, kartu išlaikant ląstelių gyvybingumą, kuris paprastai viršija 80 %. Bioprintavimo iš kelių medžiagų galimybės leidžia vienu metu arba nuosekliai nusodinti skirtingų tipų ląsteles ir medžiagas, palengvindamos heterogeninių audinių konstrukcijų su erdviškai apibrėžta sudėtimi gamybą. Koaksialinės antgalių konfigūracijos leidžia tiesiogiai spausdinti tuščiavidures vamzdelių struktūras, naudingas vaskuliarizacijai, vėliau pašalinant pagrindinę medžiagą, kad būtų galima sukurti patentinius liumenus, išklotus endotelio ląstelėmis.

Rašalinis ir lašelinis bioprintojavimas

Iš komercinių dokumentų spausdinimo sistemų pritaikytos rašalinio spausdinimo technologijos leidžia tiksliai nusodinti pikolitrų tūrio ląstelių turinčius lašelius, užtikrinant didelės skiriamosios gebos erdvinį modeliavimą ir greitą spausdinimo greitį, tinkamą didelio našumo programoms. Šiluminės rašalinio purškimo sistemos sukuria garų burbuliukus per varžinius kaitinimo elementus, sukuriančius slėgio impulsus, kurie išmeta lašelius iš spausdinimo galvutės, o pjezoelektrinės sistemos naudoja pjezoelektrinių kristalų įtampos sukeltą deformaciją, kad sukurtų akustines bangas, kurios išstumia lašelius. Iš pradžių šiluminių rašalinių purkštukų metodų taikymą ribojo ląstelių gyvybingumo problemos dėl trumpalaikio temperatūros pakilimo, tačiau optimizuotos sistemos rodo minimalią šiluminę žalą, kai temperatūra palaikoma žemiau kritinės ribos, o poveikio trukmė neviršija mikrosekundžių. Pjezoelektrinėse sistemose išvengiama šiluminio streso, tačiau reikia kruopščiai sureguliuoti akustinius parametrus, kad lašelių susidarymo patikimumas būtų suderintas su ląstelių mechaniniu poveikiu. Biologinio rašalo klampumas rašalinėse sistemose turi būti mažesnis nei maždaug 12 mPa-s, kad būtų galima suformuoti lašelius, o tai riboja medžiagų pasirinkimo galimybes, palyginti su ekstruzijos metodais, ir, norint pasiekti struktūrinį stabilumą, paprastai po nusodinimo reikia atlikti kryžminį susiejimą. Dėl didelio tikslumo ir našumo rašalinis biotryškinimas yra ypač tinkamas naudoti, kai reikia apibrėžtų erdvinių kelių tipų ląstelių modelių, pavyzdžiui, kuriant bendrų kultūrų modelius arba gradientus vaistų atrankai naudojant HeLa ląsteles ir kitas nustatytas ląstelių linijas.

Lazerinis biologinis spausdinimas ir didelės skiriamosios gebos modeliavimas

Lazeriu palaikomu biografijos spausdinimu (LAB), dar vadinamu lazeriu indukuotu tiesioginiu perkėlimu, pasiekiama didžiausia erdvinė skiriamoji geba tarp biografijos spausdinimo technologijų, todėl galima mikrometro tikslumu nusodinti atskiras ląsteles arba mažas ląstelių grupes. LAB sistemą sudaro impulsinis lazerio šaltinis, donorinis stiklelis, padengtas energiją sugeriančia medžiaga ir ląstelių turinčiu biologiniu dažikliu, ir priimantis substratas, esantis arti po donoriniu stikleliu. Fokusuoti lazerio impulsai išgarina energiją sugeriančią medžiagą, todėl susidaro didelio slėgio burbuliukai, kurie iš donorinio objektinio stiklelio ant priimančiojo pagrindo išstumia ląstelių turinčius lašelius, tiksliai kontroliuojant erdvę. Optimizavus parametrus galima pasiekti 10-50 mikrometrų skiriamąją gebą ir ląstelių gyvybingumą, viršijantį 95 %, o tai gerokai pranoksta kitus bioprinto būdus. Kadangi LAB neturi antgalių, pašalinamas su išspaudimu susijęs šlyties stresas ir išvengiama užsikimšimo problemų, kurios vargina antgaliais grindžiamas sistemas, kai spausdinama didelio klampumo ar didelio tankio ląstelių suspensija. Tačiau LAB sistemoms reikia sudėtingos optinės įrangos ir kruopštaus lazerio parametrų, įskaitant bangos ilgį, impulso trukmę, energijos tankį ir židinio taško dydį, optimizavimo, kad spausdinimo patikimumas būtų suderintas su ląstelių gyvybingumu. Galimybė spausdinti ląsteles su vienos ląstelės skiriamąja geba daro LAB ypač vertingą, kai reikia tikslios erdvinės organizacijos, pavyzdžiui, neuronų ir glijos bendrų kultūrų arba ląstelių ir ląstelių signalų tyrimų tam tikru atstumu.

Stereolitografija ir skaitmeninis šviesos apdorojimas

Stereolitografijos (SLA) ir skaitmeninio šviesos apdorojimo (DLP) bioprintografijos metodais sluoksnis po sluoksnio fotopolimerizuojami ląstelių fotokrosseliuojamieji hidrogeliai, kad būtų galima greitai pagaminti sudėtingas trimates geometrijas, kurių skiriamoji geba yra 25-100 mikrometrų. Skirtingai nuo nusodinimu pagrįstų metodų, kai struktūros kuriamos nuosekliai dedant medžiagas, šviesa pagrįsti metodai vienu metu susieja ištisus sluoksnius, todėl gerokai sutrumpėja sudėtingų geometrijų gamybos laikas. DLP sistemos projektuoja šviesos raštus, atitinkančius ištisus sluoksnių skerspjūvius, naudodamos skaitmeninių mikroveidrodžių matricas, o SLA sistemos skenuoja fokusuotus lazerio spindulius sluoksnių raštams nusakyti; DLP paprastai užtikrina didesnį spausdinimo greitį. Fotojuostelėse yra fotoiniciatorių, kurie, veikiami šviesos, generuoja reaktyviąsias rūšis, sukeliančias hidrogelinių pirmtakų, tokių kaip želatinos metakrilatas, polietilenglikolio diakrilatas ar hialurono rūgšties metakrilatas, polimerizaciją ar susisiekiojimą. Ląstelių gyvybingumas labai priklauso nuo fotoiniciatoriaus koncentracijos, šviesos intensyvumo ir ekspozicijos trukmės, nes fotoinicijavimo metu susidariusios reaktyviosios deguonies rūšys gali pažeisti ląstelių komponentus. Optimizuotose sistemose, naudojant su ląstelėmis suderinamus matomos šviesos fotoiniciatorius (ličio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinatą), mažą fotoiniciatoriaus koncentraciją (0,05-0,5 %) ir minimalų šviesos poveikį, pasiekiamas 75-95 % gyvybingumas po spausdinimo. Galimybė greitai gaminti sudėtingus kraujagyslių tinklus ir sudėtingas audinių struktūras daro SLA/DLP ypač perspektyvų organų ant lusto ir audinių inžinerijos srityje, tačiau tam reikia suderinamų fotosujungiamų medžiagų ir kruopštaus fotopolimerizacijos kinetikos valdymo.

Brandinimas po spausdinimo ir kultūrų optimizavimas

Iš karto po pagaminimo atspausdintoms biotechnologinėms konstrukcijoms paprastai būdinga ribota ląstelių ir ląstelių sąveika, minimalus ekstraląstelinio matrikso nusėdimas ir mechaninės savybės, kurias lemia biologinio rašalo medžiaga, o ne biologinio audinio savybės. Po atspaudo brandinimo kultūra yra būtina, kad ląstelės galėtų išsiskleisti iš pradinės sferinės morfologijos, susidarytų ląstelių jungtys, išsiskirtų ir organizuotųsi endogeninis ekstraląstelinis matriksas ir išsivystytų audiniams būdingos funkcijos. Priklausomai nuo ląstelių tipo, konstrukcijos sudėtingumo ir numatyto panaudojimo, kultūrų auginimo trukmės reikalavimai svyruoja nuo kelių dienų iki kelių savaičių, o metaboliškai aktyvioms ląstelėms paprastai reikia dažniau keisti terpę, kad būtų išvengta maistinių medžiagų išeikvojimo ir metabolitų kaupimosi. Ląstelių kultūrų terpės papildymas audiniams būdingais augimo veiksniais, hormonais ir kitomis biologiškai aktyviomis molekulėmis gali pagreitinti brendimą ir pagerinti funkcines savybes, nors konkretūs reikalavimai priklauso nuo ląstelių tipo ir norimo fenotipo. Mechaninė stimuliacija perfuzijos srautu, cikliniu tempimu ar suspaudimu skatina audinių brendimą ir funkcinį mechaniškai jautrių ląstelių tipų vystymąsi, imituojant fiziologines apkrovos sąlygas. Biologiškai suyrančių komponentų turinčių biologiškai suyrančių biožiedų mechaninių savybių kitimas laike atspindi ir matricos irimą, ir ląstelių išskiriamos matricos kaupimąsi, todėl reikia kruopščiai subalansuoti irimo kinetiką ir matricos nusėdimo greitį. Stebint brendimą morfologiniu vertinimu, genų raiškos analize ir funkciniais tyrimais, galima optimizuoti kultūros sąlygas ir nustatyti tinkamus laiko taškus eksperimentiniam bioprinted audinių modelių tyrimui.

Vaistų atrankinės patikros ir ligų modeliavimo taikymas

Bioprintintos audinių konstrukcijos, kuriose naudojamos nustatytos ląstelių linijos iš "Cytion" katalogo, yra galingos farmacinių junginių atrankos ir ligų modeliavimo platformos, pasižyminčios geresniu fiziologiniu tinkamumu, palyginti su tradicinėmis dvimatėmis kultūromis. Galimybė tiksliai kontroliuoti ląstelių sudėtį, erdvinę organizaciją ir mikroarchitektūros ypatybes leidžia sistemingai tirti struktūros ir funkcijos ryšius ir kurti atkuriamus audinių modelius, tinkamus didelio našumo patikros procesams. Vėžio modeliai, biotransformuoti su naviko ląstelių linijomis, stromos fibroblastais ir endotelio ląstelėmis apibrėžtomis erdvinėmis struktūromis, geriau atkuria naviko mikroaplinkos savybes, įskaitant hipoksinius gradientus, nevienodą vaistų skvarbą ir stromos bei naviko sąveiką, turinčią įtakos terapiniam atsakui. Kepenų audinių modeliai, į kuriuos įtrauktos apibrėžtos struktūros hepatocitų ląstelių linijos, pasižymi geresne citochromo P450 raiška ir metaboline funkcija, palyginti su įprastinėmis kultūromis, todėl pagerėja prognozavimo tikslumas atliekant hepatotoksiškumo atranką. Bioprintiniai nervinio audinio modeliai su tikslia neuronų ir glijos organizacija leidžia tirti neurodegeneracinių ligų mechanizmus ir atlikti neuroprotekcinių junginių atranką. Bioprintavimo atkuriamumo pranašumai, palyginti su rankiniu būdu sukurtomis trimatėmis kultūromis, palengvina standartizavimą, būtiną reguliavimo institucijų pripažinimui ir integravimui į farmacijos produktų kūrimo linijas, nors norint įsitikinti prognozavimo galimybėmis, vis dar labai svarbu patikrinti rezultatus in vivo.