2 protokolas: užšaldytų ląstelių linijų gaivinimas siekiant užtikrinti optimalų gyvybingumą ir augimą
Tinkamas užšaldytų ląstelių linijų atšildymas ir atgaivinimas yra labai svarbus ląstelių gyvybingumui ir eksperimentinės sėkmės palaikymui. Šiame išsamiame vadove aprašomi svarbiausi veiksmai ir aplinkybės, kaip atgaivinti kriokonservuotas ląsteles iš "Cytion" ląstelių linijų kolekcijos.
| Pagrindinės išvados | |
|---|---|
| ⏱️ Laikas | Labai svarbu greitai atšildyti - per 1-2 minutes |
| ?️ Temperatūra | Atšildymo metu palaikykite 37 °C temperatūrą |
| ⚠️ Svarbiausi žingsniai | Sumažinti DMSO poveikį, kai temperatūra aukštesnė nei 4 °C |
| ✔️ Sėkmės veiksniai | Išankstinis terpės pašildymas, tinkamas praskiedimo santykis, sterili technika |
Reikalinga įranga ir medžiagos
| Įranga | Medžiagos |
|---|---|
|
- Vandens vonia (37 °C) - Mikrobiologinė saugos spinta - Inkubatorius - Fazinio kontrasto mikroskopas - Centrifuga - Hemocitometras |
- Augimo terpė - 70 % izopropanolis - Iš anksto paženklintos kolbos - Sterilios pipetės - Asmeninės apsaugos priemonės (sterilios pirštinės, laboratorinis chalatas, apsauginis skydelis) - PBS |
Saugos aspektai
Ląstelių linijų gaivinimui reikia atidžiai laikytis biologinės saugos protokolų. Dirbdami su užšaldytomis ląstelių linijomis turėkite omenyje, kad skystame azote laikomos ampulės kartais gali sprogti jas šildant dėl įkalinto azoto. Su užšaldytomis ampulėmis visada dirbkite naudodami tinkamas asmenines apsaugos priemones ir atšildykite sertifikuotoje biologinės saugos spintoje.
Žingsnis po žingsnio protokolas
Atidžiai atlikite šiuos veiksmus, kad užtikrintumėte optimalų ląstelių atkūrimą ir gyvybingumą.
1. Paruošimas prieš atšildymą
- Patikrinkite ląstelių linijos duomenų lapą, kad sužinotumėte konkrečius reikalavimus
- Iš anksto pašildykite atitinkamą terpę iki 37 °C temperatūros
- Paženklinkite kolbas ląstelių linijos pavadinimu, išleidimo numeriu ir data
- Paruoškite sterilią biologinės saugos spintą
2. Saugus ampulių paėmimas
- Užšaldytą ampulę iš skystojo azoto saugyklos perneškite tinkamoje talpykloje
- Dėvėkite apsauginį veido skydelį ir izoliuotas pirštines
- Ampulę prilaikykite alkoholiu suvilgytu audiniu
- Atlaisvinkite dangtelį ketvirtadaliu apsisukimo (išleidžiamas įkalintas N2), tada vėl priveržkite
3. Atšildymo procesas
- Greitai atšildykite 37 °C vandens vonioje (1-2 min.)
- Išlaikykite nedidelius ledo kristalus
- Dangtelį laikykite virš vandens lygio
- Dezinfekuokite ampulės išorę 70 % alkoholiu
4. Ląstelių perkėlimas
- Perpilkite turinį į sterilų mėgintuvėlį
- Lėtai įpilkite 5 ml iš anksto pašildytos terpės
- Pasirinktinai: Patikrinkite gyvybingumą, naudodami tripano mėlynąją ekskliuziją
- Perkelkite į kultūrų kolbą rekomenduojamu tankumu
5. Priežiūra po atšildymo
Prigludusioms ląstelėms:
- Sureguliuokite terpės tūrį pagal kolbos dydį
- Pirmą kartą keičiant terpę pašalinami krioprotektoriaus likučiai
- Patikrinkite prisitvirtinimą po 4-6 valandų
Suspenduotoms ląstelėms:
- Centrifuguoti 150 x g greičiu 5 min
- Resuspenduokite šviežioje terpėje
- Palaikykite rekomenduojamą ląstelių tankį
Gedimų šalinimo vadovas
| Problema | Sprendimas |
|---|---|
| Mažas gyvybingumas | - Patikrinkite atšildymo greitį - Patikrinkite terpės temperatūrą - Užtikrinkite tinkamą kriokonservavimo terpę |
| Prastas prisitvirtinimas | - Patvirtinkite paviršiaus padengimo reikalavimus - Patikrinkite sėjimo tankį - Patikrinkite terpės priedus |
| Užterštumas | - Ištirkite, ar nėra mikoplazmos - Peržiūrėkite sterilią techniką - Patikrinkite terpę ir (arba) priedus |
Kokybės kontrolės etapai
- Ląstelių apžiūra po 24 valandų
- Patikrinkite, ar morfologija atitinka laukiamas savybes
- Užfiksuokite atsinaujinimo lygį ir gyvybingumą
- Jei reikia, atlikite autentiškumo nustatymo tyrimus
Dokumentacijos reikalavimai
| Įrašykite | Informacija, kurią reikia įtraukti |
|---|---|
| Ląstelių linijos informacija | - Šaltinis ir katalogo numeris - Eigos numeris - Atšildymo data |
| Proceso duomenys | - Gyvybingumo įvertinimas - terpės sudėtis - Augimo sąlygos |
| Kokybės patikrinimai | - Morfologiniai stebėjimai - Užterštumo būklė - Augimo greitis |
Laikymas ir nuorodos
Išsamius reanimacijos proceso įrašus saugokite laboratorijos užrašų knygelėje. Įrašykite naudotų terpių ir papildų partijų numerius. Kad ląstelės ir toliau optimaliai augtų, vadovaukitės konkrečiomis ląstelių auginimo gairėmis.
Išvada
Sėkmingas ląstelių linijų gaivinimas priklauso nuo kruopštaus pasiruošimo, greito atlikimo ir tinkamos technikos. Laikantis šio protokolo užtikrinamas optimalus ląstelių gyvybingumas ir eksperimentinis atkuriamumas. Dėl konkrečių ląstelių linijai keliamų reikalavimų visada kreipkitės į savo analizės sertifikatą.
Svarbūs priminimai
- Sumažinkite DMSO poveikio laiką
- Dirbkite greitai, bet išlaikykite sterilumą
- Dokumentuokite visus veiksmus
- Stebėkite ląstelių atsistatymą per pirmąsias 24 valandas