ヒト初代細胞

ヒトの初代細胞とは何ですか？

初代細胞とは、それぞれの組織を最も純粋な形で表す細胞のことです。これらは組織から分離され、理想的な条件下で培養環境に定着できるよう処理されます。 これらは、改変されたものではなく組織から直接由来しているため、生体内状態をより忠実に再現し、正常な生理機能を示します。このため、細胞薬理学、毒性学、生理学（代謝、老化、シグナル伝達に関する研究を含む）の研究において有用なモデルとして活用できます。 初代細胞は、寿命が短く、一定回数の細胞分裂後に分裂を停止（あるいは老化）するため、連続細胞株に比べて培養や維持がより困難であることに留意してください。 細胞シグナル伝達経路の研究は、ドナーから採取された初代細胞に固有の変動性や、継代培養の過程による変動性によって複雑化します。シグナル伝達研究を開始する前に、研究者はしばしばスクリーニングを行い、細胞が一般的に使用される刺激に反応するかどうかを判定します。時間と費用の無駄を避けるため、スクリーニングを行う前に、初代細胞を刺激して主要なシグナル伝達経路を活性化させておくことができます。

なぜヒト初代細胞を用いるのか？

不死化細胞株は、細胞アッセイとして一般的に使用されています。しかし、科学者たちは、細胞株に起因する生物学的変化が、その生理学的意義を研究する上で有害となり得ることを認識しています。ヒト初代細胞を使用することで、細胞培養を通じて得られるデータの生理学的価値が高まり、生物学的プロセス、疾患の進行、および創薬の研究において重要であるとますます認識されるようになっています。

ヒト初代細胞は、細胞間および細胞内コミュニケーション、発生生物学、ならびにがん、パーキンソン病、糖尿病のメカニズムに関するin vitro研究をはじめ、その他多くの前臨床および基礎生物学研究分野で広く利用されている。 研究者たちは長い間、組織機能を研究するために不死化細胞株を使用してきました。しかし、明らかな変異や染色体異常を持つ細胞株は、正常な細胞や疾患の初期段階の進行を代用する適切なモデルとは言い難い場合があります。 現在では、特定の組織から分離し、初代細胞培養培地および補足培地で維持されたヒト初代細胞を使用することで、特定の組織細胞タイプをより正確にモデル化することが可能となっています。

初代細胞培養とは何か？

不死化細胞株の代わりに、初代細胞培養では、体外で多細胞生物から直接細胞を培養します。英国など一部の国では、初代細胞培養が細胞株よりも生体内の組織をよりよく代表しているという事実が法的に認められています。 とはいえ、初代細胞は増殖するために適切な基質と栄養素を必要とし、一定回数の分裂を経ると、分裂を永久に停止させる老化表現型を発現します。これら2つの要因が、細胞株作製の動機となっています。 自然不死化された初代細胞（例：HeLa細胞）も、人工的に不死化された初代細胞（例：HEK細胞）も、細胞培養において無期限に培養することが可能です。

組織タイプ別のヒト初代細胞

上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、内皮細胞、筋細胞、免疫細胞、および間葉系幹細胞のような幹細胞は、科学的研究において最も一般的に使用されるヒト初代細胞に含まれます。 そもそも、これらの培養は不均一であり（組織内に存在する細胞種の混合を反映している）、in vitroでは一定期間しか生存を維持できない。形質転換とは、ヒト初代細胞を操作して無制限に継代培養できるようにするin vitroのプロセスである。 形質転換は自然発生する場合もあれば、化学物質やウイルスによって誘導される場合もあります。遺伝子形質転換を経た一次培養は、十分な栄養素と空間が与えられれば、不死化された二次細胞株へと無期限に分裂し続けることができます。

内皮細胞

がん治療、創傷治癒、細胞シグナル伝達研究、ハイスループットおよびハイコンテンツスクリーニング、毒性スクリーニングなどは、研究ツールとして一次内皮細胞を活用することで恩恵が得られる分野のほんの一例に過ぎない。

ケラチノサイト

成人の皮膚または新生児の包皮の表皮に由来するケラチノサイトは、乾癬や癌などの皮膚疾患の研究において極めて重要な役割を果たしています。

上皮細胞

がん研究から毒性学的調査に至るまで、初代上皮細胞は、生体の自然な防御機構をモデル化する上でかけがえのない資源であることが実証されています。

線維芽細胞

iPS細胞の誘導や創傷治癒の研究は、初代線維芽細胞の多くの用途のほんの一部に過ぎません。

免疫細胞

末梢血単核細胞（略してPBMC）は、円形の細胞核を持つ血液中の単核細胞です。これらは主にリンパ球と単球から構成されており、免疫応答の過程で重要な役割を果たします。 末梢血単核細胞は、感染症の診断や、ワクチンによる予防効果の有無を検出するためによく使用されます。T 細胞が媒介する細胞性免疫反応に関する知見は、多くの場合、極めて重要です。

メラノサイト

色素メラニンを産生する皮膚の特殊細胞であるメラノサイトは、創傷治癒、毒性、悪性黒色腫、紫外線（UV）照射に対する真皮の反応、皮膚疾患、化粧品などの研究におけるモデルとして有用です。

幹細胞

幹細胞は、多種多様な細胞タイプに分化する可能性を秘めています。その分化能力により、ヒトの組織や健康状態をモデル化する新たな可能性をもたらしています。

間葉系幹細胞

間葉系幹細胞（MSC）は、骨髄、脂肪（脂肪組織）、臍帯組織（ワートンゼリー）、羊水（胎児を包む液体）など、ヒトのさまざまな部位から採取することができ、体外で増殖させることができます。 これらの成体間葉系幹細胞は、多種多様な細胞タイプへと分化できる能力を持っています。その細胞タイプには、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞、皮膚細胞、角膜細胞などが含まれます。

平滑筋細胞

中空臓器内では、一次平滑筋細胞（SMC）が内壁を覆い、収縮性を媒介しています。がんやその他の疾患に加え、SMCは高血圧性線維化のモデルとしても利用可能です。

初代細胞と細胞株

形質転換されたがん細胞株に見られるような自然変異によるものであれ、がん遺伝子の人工的な導入に見られるような意図的な改変によるものであれ、連続培養細胞株は無限に増殖する（不死化）能力を獲得しています。原則として、連続培養細胞株は初代細胞よりも信頼性が高く、取り扱いが容易です。 これらは無期限に増殖させることができ、重要なデータへの迅速なアクセスを可能にする。連続培養細胞株の使用には一定の制限があり、それには、遺伝的に改変／形質転換されているため生理学的特徴が変化し、生体内（in vivo）の状態と一致しなくなる可能性があること、また、多回の継代を経ることで時間が経つにつれてさらに変化する可能性があることが含まれる。

初代細胞培養の進歩

初代細胞は、取り扱いが難しいことで悪名高い。しかし、初代細胞培養技術の発展、完全に最適化されたプロトコルを備えた市販の初代細胞の入手可能性、およびより少ない手間で済む新しい解析技術のおかげで、そのプロセスはかつてないほど容易になりつつある。

2次元（2D）細胞培養から3次元（3D）細胞培養への移行は、この分野における重要なマイルストーンと見なされている。2D培養では、組織特異的な構造、細胞間相互作用、および機械的・生化学的シグナル伝達が弱まる可能性がある。したがって、これらの培養の生物学的価値には限界がある。

一方、3次元細胞培養では、細胞が増殖し、3次元の細胞外骨格と相互作用することが可能になります。これにより、細胞同士や細胞外マトリックスとの相互作用が促進され、3次元培養はより生理学的に妥当なものとなります。 生体内での反応を予測するこの手法の精度の高さにより、創薬や医薬品開発などの分野において革命的な進歩をもたらした。このため、患者由来のオルガノイドや「臓器オンチップ」といった最先端技術は、薬剤スクリーニングや開発のための極めて文脈に沿ったモデルを提供している。

初代細胞の作製は、初代培養におけるボトルネックとなっている。 これを克服するには通常、より多くの組織量が必要となるが、その確保は困難な場合がある。しかし、分析感度の向上により、新たな道が開かれつつある。例えば、シーケンシング、ウエスタンブロッティング、マスサイトメトリーなどの単一細胞技術を活用することで、大量の初代細胞を培養する必要性が軽減されている。

初代細胞培養の有望な展望

技術の進歩により、初代細胞培養が抱える全体的な課題は緩和されつつあります。その結果、この手法は細胞生物学および分子生物学の研究・実践におけるゴールドスタンダードとして、他の手法に急速に取って代わりつつあります。ワクチン製造、臓器移植、幹細胞治療、がん研究など、多くの分野が初代細胞培養の継続的な進歩から多大な恩恵を受けることが期待されます。

初代細胞培養のヒントとコツ

細胞増殖の要件

初代細胞を培養する最も一般的な方法は、浮遊培養と表面（2D）培養の2つです。一部の細胞（例えば末梢血由来の細胞など）は、表面に付着することなく、血流中で自由に浮遊することができます。 一方、懸濁培養下で増殖するように遺伝子改変された細胞株もあり、これらは2次元（2D）培養条件下では達成不可能な密度に達することが可能です。体外で増殖するために付着を必要とする一次細胞は「付着性細胞」と呼ばれ、固形組織に存在する細胞などがこれに含まれます。 接着性を高め、増殖や分化に必要なその他のシグナルを供給するために、これらの細胞は通常、コーティングされていない平らなプラスチック容器で培養されますが、場合によってはマイクロキャリアが使用されることもあります。後者の場合、マイクロキャリアは細胞外マトリックスタンパク質（コラーゲンやラミニンなど）でコーティングされていることがあります。 細胞培養に使用される培地は、適切な成長因子やサイトカインが添加された基本培地で構成される。細胞インキュベーターは、特定の温度およびガス混合比（哺乳類細胞の場合は通常37 °C、5% CO₂）で細胞を培養・維持するために使用される特殊な実験用インキュベーターである。 培養する細胞の種類によって、最適な条件は大きく異なる。培養する細胞の種類に応じて、最適な培養液には、pH、グルコース濃度、成長因子、その他の栄養素の存在など、独自の因子の組み合わせが含まれる。

一次培養の確立段階では、宿主組織からの汚染を防ぐために、培養液中の抗生物質が極めて重要となる。 ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンBを組み合わせた抗生物質レジメンもあります。ただし、一部の試薬（アムホテリシンBなど）は長期的には細胞に毒性を及ぼす可能性があるため、抗生物質を長期間使用することは推奨されません。

ほとんどの初代細胞は、一定回数の細胞数倍増を経て老化し、分裂を停止するため、分離後も細胞を生き続けさせることは極めて重要です。 細胞の長期的な生存には、専門的な細胞培養技術と理想的な培養条件（適切な培地、適切な温度、適切なガス混合、適切な pH、適切な濃度の成長因子、栄養素の存在、およびグルコースの存在など）が必要です。 培地の補足に使用される成長因子の多くは動物の血液から得られるため（血液由来の成分には汚染の可能性がある）、その使用は最小限に抑えるか、あるいは完全に避けることが推奨されます。また、無菌操作を行うことも重要です。

継代培養と維持

単離された細胞が培養皿の表面に付着した時点で、維持段階が始まります。付着は通常、培養開始から24時間後に起こります。 細胞は、一定のコンフルエンス率に達し、活発に増殖している段階で継代を行うべきである。コンフルエンスに達した後の細胞は分化を起こしたり、継代後に増殖速度が低下したりする可能性があるため、初代細胞培養はコンフルエンスが100％に達する前に継代を行うのが最善である。

新鮮な培地での継代は、付着依存性細胞の指数関数的増殖を維持する。単層の継代は、細胞間および細胞内の細胞表面相互作用を断ち切る。 トリプシン／EDTAなどの低濃度のタンパク質分解酵素を用いて、単層や組織から付着した一次細胞を抽出する。細胞が分散され、単一細胞溶液に希釈された後、細胞数を計数し、新しい培養容器に移して再付着・増殖させる。

凍結保存と回復

凍結保存とは、生細胞を低温で凍結させることで保存する方法である。ヒト初代細胞を凍結保存・解凍することで、保存および使用中の細胞死や損傷を防ぐことができる。ヒト初代細胞の凍結保護には、DMSOまたはグリセロールが用いられる（適切な温度および制御された凍結速度下で）。 氷晶の形成を防ぐため、凍結プロセスは1分あたり-1 °Cの速度で段階的に行わなければなりません。長期保存には、液体窒素（-196 °C）または-130 °C以下の温度が必要です。

凍結した細胞を37 °Cの水浴に約1～2分間浸すだけで、凍結保存された細胞を解凍できます。ヒト初代細胞は、冷凍庫から取り出して解凍した後、遠心分離を行ってはなりません（凍結保存からの回復過程において、損傷に対して極めて敏感であるため）。 解凍直後に細胞をプレートに播種するのに適しており、播種後の最初の24時間における培養での付着を促進します。1 凍結保存された初代細胞が付着した後、使用済みの培地は除去する必要があります（DMSOは初代細胞に有害であり、解凍後の生存率の低下を引き起こす可能性があるため）。