公開日：2023年 | 最終更新日：2026年5月

細胞凍結の総合ガイド：生存率と無菌性の確保

細胞の凍結は、細胞培養管理において極めて重要なプロセスであり、貴重な細胞株の長期保存と維持を可能にします。ヒト細胞であれ動物細胞であれ、正確なプロトコルに従い、厳格な無菌操作を維持することが、凍結保存を成功させるために不可欠です。

本ガイドでは、細胞の生存率と無菌性を維持しながら効果的に凍結するために必要な材料、試薬、および段階的な手順について詳細に解説します。これらのガイドラインに従うことで、研究者は細胞の生存率を最小限の損失に抑え、実験結果の完全性と信頼性を維持しながら、自信を持って細胞培養を保存し、後日復活させることができます。

まず、無菌的な作業環境を整えることが不可欠です。適切な無菌操作は、汚染を防ぎ、培養物の無菌性を確保する上で極めて重要な役割を果たします。

無菌操作

培養物の無菌性を確保するため、プロセス全体を通じて無菌操作を遵守してください。

包括的な細胞凍結プロセス

このフローチャートは、細胞を適切に凍結するために必要な手順を詳細に視覚的に示したものです。凍結保存プロセス中に高い細胞生存率と完全性を確保するために、これらの手順に従ってください。

凍結培地の調製

細胞の種類に応じて、凍結保護液を調製してください：

FBS含有培地培養：90% FBS + 10% DMSO または 70% 増殖培地、20% FBS、10% DMSO
グリセロールを必要とする細胞：90% FBS + 10% グリセロール

当社の既調製凍結培液のご利用をご検討ください：

凍結培地 CM-1：胎児牛血清（FBS）を含む培地を必要とするプロトコル用
凍結培地 CM-ACF - 無血清：FBSを含まない代替品として

ラベル付けと記録

クライオバイアルには以下の詳細を記載してください：

日付
研究者名
細胞番号
継代数
細胞の種類
その他の情報（例：遺伝子改変など）

細胞の調製

付着性細胞の場合：

細胞が85～95%の密接度に達するまで観察する
古い培養液を吸引して除去する
カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで細胞単層を洗浄する
Accutase、トリプシン、またはトリプシン-EDTAを用いて細胞を剥離し、必要に応じて培養液で中和する
細胞懸濁液を50 mLのファルコンチューブに移す

浮遊細胞の場合：

顕微鏡下で細胞密度と状態を確認する
細胞懸濁液を直接50 mLのファルコンチューブに移す

細胞計数および遠心分離

血球計数板または自動細胞計数機を用いて細胞を計数する
室温で300g、3～5分間遠心分離し、細胞を沈殿させる
細胞沈殿を乱さないよう注意しながら、上清を慎重に吸引する
調製した凍結培地は、使用前に37°Cまで温めておく

凍結保存

細胞沈殿を凍結培地で再懸濁し、付着細胞の場合は 200 万細胞/mL、浮遊細胞の場合は 500 万細胞/mL、あるいは希望する濃度に調整する
細胞懸濁液を 1.0 mL（または必要に応じてそれ以上）ずつ、ラベルを付けた凍結用バイアルに分注します。
細胞を長期保存に移す前に、緩慢凍結法を使用してください

？方法: ? 手順
❄️ 手動凍結: 1️⃣ 凍結培地に入れた細胞を4°Cの冷凍庫で40分間放置します。
2️⃣ -80°Cの冷凍庫に移し、24時間保管します。
3️⃣ 長期保存のため、細胞を液体窒素で保存します。
? Mr. Frostyの使用: 1️⃣ 凍結培地を入れたクライオバイアルに細胞を準備します。
2️⃣ クライオバイアルをMr. Frostyの容器に入れます。
3️⃣ 液体窒素に移す前に、-80°Cで24時間保存します。
? 制御式冷凍機: 1️⃣ 装置をプログラムし、温度を徐々に下げるように設定します。
2️⃣ 準備した細胞をフリーザーに入れます。
3️⃣ 凍結サイクル終了後、細胞を液体窒素に移します。

長期保存のため、クライオバイアルを-130°C以下の温度、または液体窒素中で保管してください。

材料および試薬

1～2 mL クライオバイアル
CoolCell® 凍結装置または制御凍結装置
凍結保護凍結培地（例：自作の凍結保護培地、CM-1、CM-ACF、または専用培地）
胎児牛血清（FBS）または培養上清
DMSO またはグリセロール
カルシウム・マグネシウムフリーPBS
Accutase、トリプシン、またはトリプシン-EDTA（接着性細胞用）
15 mL または 50 mL ファルコンチューブ
血球計数板または自動細胞計数装置
遠心分離機