公開日：2023年 | 最終更新日：2026年5月

細胞培養の剥離技術

細胞培養における細胞の剥離は、細胞培養を維持する上で重要な工程です。これは、継代培養や回収を可能にするために、細胞を培養面から剥離させることを指します。本節では、酵素を含まない剥離バッファーを使用する方法と、酵素試薬を使用する方法という2つの主要な手法について概説します。

酵素を含まない細胞剥離バッファーの使用

この方法は穏やかで、酵素を使用せずに細胞の完全性を維持します：

1. 準備
   • 細胞へのショックを避けるため、使用前にすべての試薬を37°Cに温めておく。
2. 培養液の除去：
   • 培養容器から古い培液を廃棄します。
3. 洗浄
   • T75フラスコまたは100 mmディッシュ1つにつき、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS 5 mlで細胞単層を洗浄します。
   • 室温で30～60秒間、容器を優しく揺すります。
   • 洗浄液を吸引して廃棄します。
   • この洗浄手順をもう一度繰り返します。
4. 細胞の分散
   • 酵素を含まない細胞解離バッファーを約 5 ml、容器に加えます。
   • 室温で 1～2 分間穏やかに揺らし、顕微鏡で解離を確認します。
   • 必要に応じて、フラスコやディッシュを手で軽く叩いて細胞を剥がします。
   • 細胞が付着している場合は、室温でさらに 2～5 分間放置し、必要に応じて、さらに分離バッファーを追加して、再び軽く叩きます。
   • 細胞が剥離したら、少なくとも 5 ml の完全培地を加えて分離バッファーを中和し、細胞を再懸濁させます。
5. 生存率の確認
   • 継代培養中は細胞の生存率を監視し、90% 以上を維持するようにしてください。

解離に他の試薬を使用する場合

この方法では、様々な剥離試薬を使用することができます：

1. 使用済み培地の除去
   • 培養容器から使用済みの培地を廃棄する。
2. 細胞の洗浄
   • カルシウムおよびマグネシウムを含まない平衡塩溶液、またはEDTAを用いて細胞を洗浄します。
   • 洗浄液を細胞の反対側に静かに加え、1～2分間容器を揺らしてから、洗浄液を廃棄します。
3. 細胞の分散
   • 培養面積 25 cm² あたり、選択した分散液を 2～3 ml 添加し、細胞シート全体が覆われるようにします。
   • 容器を 37°C でインキュベートし、穏やかに揺すります。細胞株にもよりますが、通常 5～15 分で分散します。
   • 分離しにくい細胞の場合は、容器を軽く叩くことでプロセスを早めることができます。
   • 過度の曝露や損傷を防ぐため、細胞を注意深く観察してください。
4. 細胞の回収
   • 細胞が完全に剥離したら、容器を直立させて、細胞を容器の底に集めます。
   • 完全培地を加え、細胞層の上にピペットで液を垂らして細胞を分散させ、回収します。
   • 細胞数を数え、継代を行います。

どちらの方法においても、経験的な観察を通じて各細胞株に最適な条件を見極めることが重要です。このプロセスでは細胞の生存率を維持する必要があり、継代中は常に 90% 以上であることを確認してください。これらの手順は、研究者がそれぞれの細胞株の特定の要件や特性に基づいて適応するための基礎となります。

付着性細胞の継代培養技術の概要

接着性細胞の効果的な継代には、培養容器からの剥離が必要です。細胞の種類や条件に応じて、様々な方法が用いられます。剥離法を選択する際には、細胞株の特定のニーズと実験の目的を考慮することが極めて重要です。 継代時の細胞生存率を90%以上に保つことを目標に、細胞の生存率を定期的にモニタリングすることは、培養の健全性と生産性を維持するために不可欠である。以下に、これらの手順の概要を示す：