HEK293 rakud: Kaasaegsete raku-uuringute ja biotehnoloogia nurgakivi
Inimese embrüonaalse neeru 293(HEK293) rakud on inimese embrüonaalse neeru rakuliin, mis on saavutanud laialdase populaarsuse teadusringkondades nende mitmekülgsuse ja kasulikkuse tõttu mitmesugustes teadusuuringutes. Rakuliin loodi 1970. aastate alguses ja seda on sellest ajast alates kasutatud vaktsiinide arendamiseks, vähiuuringuteks, ravimite testimiseks ja signaaliülekandeks. Selles blogipostituses uuritakse kõiki HEK293 rakuliini aspekte, sealhulgas selle päritolu, teavet kasvatamise kohta, eeliseid ja puudusi, rakendusi ja ressursse.
HEK293 rakud: HEKE: Üldine teave ja päritolu
Mis on HEK293 rakud?
HEK293 rakud on inimese embrüonaalne neerurakuliin, mis on saadud teadmata vanemate hulgast valikuliselt katkestatud inimese embrüo neerukoes. Rakud rajas hollandi bioloog Alex Van der Eb 1970. aastate alguses. Hiljem immortaliseeris neid teadlane Frank Graham trükeldatud adenoviirusega 5 transformeerimise teel.
Esialgu tundus, et rakke on keeruline transformeerida. Kuid pärast mitmeid pidevaid jõupingutusi juhtus rakkude kasvamine isoleeritud üksikust transformeeritud kloonist [1]. Raku transfektsioon adenoviirusega 5 viis raku genoomi E1A ja E1B geenide lisamiseni, mis takistab raku surma ja võimaldab ohtralt valke toota. Enne immortaliseerimist ei olnud loote neerurakud piisavalt iseloomustatud, mistõttu nende täpne rakutüüp on teadmata.
Embrüonaalsed neerud koosnevad endoteeli-, epiteeli- ja fibroblastirakkudest, nii et HEK 293 rakud kuuluvad tõenäoliselt nende rakkude hulka. Siiski viitavad mRNA ja geenitooted sellele, et tegemist on neuronaalsete rakkudega. Võimalik, et Ad5 lisamine muutis rakkude fenotüüpi ja geeniekspressiooni. Lõbus fakt: "293" HEK293-s viitab Grahami tehtud 293. eksperimendile.
Lõbus fakt: "293" HEK293-s viitab Grahami tehtud 293. eksperimendile.
HEK293 rakkude omadused
- Morfoloogia
- Raku suurus
- Genoom ja ploidsus (kromosoomide arv)
HEK293 rakud on epiteelirakke meenutava kujuga. Embrüonaalsed neerud koosnevad peamiselt fibroblastidest, endoteelidest ja epiteelirakkudest. Seega sarnanevad 293 rakud oma kuju poolest ühele neist rakutüüpidest.
HEK 293 rakkude suurus jääb vahemikku 11-15 µm, mida võivad mõjutada kasvatustingimused. Kultuuris võivad rakud tunduda lamedad, kui neid kasvatatakse pinnal, või ümarad suspensioonis. HEK293 rakud on hüpotriploidsed ja umbes 30% HEK293 rakkude modaalne ploidsus on 64 kromosoomi, kuid mõnel rakul on isegi rohkem kromosoomi. Rakkudel on ka kolm X-kromosoomi koopiat ja 19. kromosoomile integreeritud 4 kilobaasipaari suurune adenoviiruse 5 fragment.
HEK293 Vs. rakuliini HEK293T võrdlus
HEK 293 vanemrakkudest on saadud mitmeid tuletisi, näiteks tavalised 293 rakkude tuletised HEK293T ja HEK293F rakud. HEK293T rakud on üks kõige laialdasemalt kasutatavaid tuletisi, mis on loodud temperatuuritundliku SV40 T-antigeeni mutandi lisamisega algsesse HEK 293 raku genoomi. T-antigeeni ekspressioon võimaldab transfekteerimisel 293-T rakkudesse paljundada SV40 replikatsiooni algupäraga plasmiide, mis viib rekombinantsete valkude suurema tootmiseni [2]. Lisateavet HEK-rakuliinide derivaatide kohta, sealhulgas nende arengu ja omaduste kohta, leiate sellest ülevaateartiklist.
HEK293 rakkude kasvatamise alused: A Step-by-Step Guide: A Step-by-Step Guide
|
Tingimused |
Teave |
|
Populatsiooni kahekordistumise aeg |
HEK293 rakuliini kahekordistumisaeg jääb vahemikku 24-45 tundi, keskmiselt 30 tundi. |
|
Adherentsed või suspensioonikultuurid |
HEK293 rakke saab kasvatada nii adherentses kui ka suspensioonilises vormis. Adherentsed rakud kasvavad monokihina, samas kui suspensioonikultuurid kasvavad sferoididena. |
|
Külvikutihedus |
Jagage rakud kasvufaasis 80-90% konfluentsuse juures. Eraldage rakud Accutase'i abil ja külvake tihedusega 1 kuni 4 x 104 rakku/cm2 . Külvitiheduse 1 x 104 rakku/cm2 korral moodustub konfluentne kiht 4 päeva jooksul. |
|
Kasvukeskkond |
Kasvatada Eagle's Minimum Essential Medium'is (EMEM), mis sisaldab 2 mM L-glutamiini ja 10% veiste loote seerumit (FBS). Vahetage keskkonda kaks korda nädalas. |
|
Kasvutingimused (temperatuur, CO2) |
Hoida niiskendatud inkubaatoris temperatuuril 37 °C ja 5% CO2-ga, et tagada optimaalne kasv. |
|
Säilitamine |
Säilitada pikaajalise säilitamise eesmärgil vedelas lämmastikus aurufaasis või vedelas faasis. Vältida säilitamist -80 °C sügavkülmikus, kuna see võib mõjutada rakkude elujõulisust. |
|
Külmutamisprotsess ja keskkond |
Parima säilitamise tagamiseks kasutage aeglast külmutamismeetodit. Külmutada CM-1 või CM-ACF külmutuskeskkonnas, mis on saadaval CLS-is. |
|
Sulatamisprotsess |
Külmutatud rakke sulatatakse 37 °C veevannil 1-2 minutit, kuni alles jääb väike jääklomp. Viige rakususpensioon tsentrifuugitorusse ja lisage eelsoojendatud kasvukeskkond ning tsentrifuugige, et eemaldada külmutuskeskkonna komponendid. Resuspenseerige rakupellet värskes söötmes ja kasvatage seda optimaalsetes tingimustes. |
|
Bioturvalisuse tase |
HEK293 rakud nõuavad 1. bioloogilise ohutuse taseme käitlemist. |
Ostke HEK293 rakke oma Discoveries jaoks
Teie murranguliste uuringute jaoks kaaluge meie HEK293 rakke, mis on tuntud oma mitmekülgsuse poolest geeniekspressiooni uuringutes ja vaktsiinide väljatöötamisel, ning selliseid derivaate nagu HEK293T, HEK293 suspensiooniga kohandatud, HEK293T/17, AAV-293 ja 2V6.11. Avastage rohkem ja täiustage oma katseid, uurides meie tootevalikut siin.
HEK293 rakuliin teadusuuringutes ja tööstuses
HEK293 rakkude rakendused on mitmekesised ja olulised. Neid kasutatakse sageli rekombinantsete valkude ekspressiooni ja tootmise süsteemina. Tänu nende inimpäritolu tõttu on nendes rakkudes toodetud valgud oma struktuuri ja funktsiooni poolest tõenäolisemalt sarnased oma looduslikele inimvalkudele, mis on terapeutiliste rakenduste jaoks ülioluline.
Lisaks kasutatakse HEK293 rakke sageli geenide funktsiooni ja regulatsiooni uurimisel, kuna nad võtavad kergesti vastu võõrast DNA-d, mis teeb neist suurepärase mudeli geneetiliseks manipulatsiooniks. Need rakud mängivad olulist rolli ka adenoviirusvektorite tootmisel, mida kasutatakse geeniteraapias ja vaktsiinide väljatöötamisel, sealhulgas COVID-19 vaktsiinide kiireks genereerimiseks.
Vaktsiini ja valkude tootmine: HEK 293 rakud sobivad valkude ja terapeutiliste vaktsiinide laiaulatuslikuks tootmiseks. Seda rakuliini kasutatakse ka viirusvektorite, näiteks adenoassotsiaalsete ja adenoviirusvektorite tootmiseks. Hiljuti kasutati HEK293 rakke olulise rekombinantse valgu, erütropoetiini (EPO) tootmiseks.
Narkootikumide testimine: HEK293 rakke kasutatakse sageli ravimite ja looduslike toodete toksilisuse testimiseks.
Vähiuuringud: 293 rakud on kasvajalised ja olulised geeniekspressiooni muutused võivad selles rakuliinis süvendada kasvajate teket. Seetõttu kasutatakse 293 rakuliini sageli vähiuuringutes, et mõista selle aluseks olevaid molekulaarmehhanisme ja ravimite väljatöötamist.
Transfektsiooniuuringud: Transfektsioon on nukleiinhapete viimine rakkudesse ja HEK293 rakud on selleks protsessiks eriti sobivad. Selle teema kohta on rohkem selgitusi allpool.
HEK293 roll vaktsiinide ja valkude tootmisel
Vaktsiinide tootmisel on HEK293 rakud olnud olulised adenoviirusel põhinevate vaktsiinide väljatöötamisel. Nende võime kasvada suspensioonikultuurides võimaldab skaleeritavaid protsesse, mis on globaalse vaktsiinivajaduse rahuldamisel väga oluline. Lisaks on nende inimpäritolu eelis teiste rakuliinide ees, kuna nad suudavad teha inimesele sarnaseid posttranslatiivseid modifikatsioone, mis tagab toodetud vaktsiinide bioloogilise tõhususe.
HEK293 rakkude mitmekülgsus laieneb ka keeruliste valkude, sealhulgas monoklonaalsete antikehade ja biosimilaaride tootmisele, mida kasutatakse vähi, autoimmuunhaiguste ja muude haiguste raviks. Nende võime valke täpselt voltida ja modifitseerida muudab nad rekombinantsete valkude tootmise valdkonnas eelistatud valikuks.
Miks kasutatakse transfektsiooniks HEK293 rakke?
Transfektsioon on protsess, mille käigus viiakse rakkudesse nukleiinhappeid ja HEK293 rakud on selleks protsessiks eriti sobivad. HEK293 rakke eelistatakse transfektsiooniks mitmel põhjusel:
- Kõrge transfektsiooni tõhusus: HEK293 rakkudel on kõrge võõra DNA vastuvõtmise määr, mis on tingitud nende võimest ekspresseerida teatavaid viiruse geene, mis hõlbustavad DNA sisenemist rakku.
- Vastupidav kasv: Need rakud kasvavad kiiresti ja neid on suhteliselt lihtne hooldada, mis on kasulik katsete puhul, mis nõuavad kiireid ja usaldusväärseid tulemusi.
- Kohandatavus: HEK293 rakke saab kasvatada mitmesugustes tingimustes, sealhulgas adherentsetes või suspensioonikultuurides, mis muudab need sobivaks suuremahuliseks valkude tootmiseks.
- Inimese rakuliin: Inimese rakuliinina pakuvad nad asjakohasemat bioloogilist konteksti inimese bioloogia jaoks, mis on eriti oluline terapeutilistes uuringutes, kus vastus inimese rakkudes ennustab in vivo tulemusi.
- Mitmekülgsus: Nad on võimelised tootma keerukate translatsioonijärgsete modifikatsioonidega valke, mis on paljude valkude, eriti terapeutiliste antikehade funktsionaalsuse seisukohalt oluline.
HEK293 subkultuuriprotokoll
Vajalikud reaktiivid
- 1X fosfaadiga puhverdatud soolalahus (PBS)
- 10% trüpsiin-PBS
- Dulbecco modifitseeritud Eagle's Medium (DMEM)
Menetlus
Rakkude ettevalmistamine
- Kontrollige HEK rakke mikroskoobi all, et need oleksid umbes 90% ulatuses konfluentsed.
- Puhastage töökoht, kasutades aseptilisi võtteid, ja steriliseerige suitsutuskapp UV-valgusega.
- Pühkige tööruum 70% etanooliga.
- Soojendage kõik reaktiivid eelnevalt 37 °C veevannis.
Jagatud fraktsiooni ja seemne koguse arvutamine
- Määrake jagatud fraktsioon, tavaliselt vahemikus 1:5 kuni 1:20.
- Arvutage pipettimise maht, kasutades valemit: Vp = (S)(Vd).
Meediumimahud ja jagamisprotokollid
Rakukultuuride puhul vajavad erinevad anumad spetsiifilisi meediumimahte ja neil on ainulaadsed kasvualad. Näiteks 6-küvettal on kasvupindala 4,67 cm^2 kaevu kohta ja vajab umbes 2,5 ml keskkonda, samas kui 100 mm plaadil on 55 cm^2 kasvupindala, mis nõuab 10 ml keskkonda. Rakkude jagamise protsess hõlmab vana meedia eemaldamist, pesemist PBSiga, inkubeerimist Accutase'iga, neutraliseerimist DMEMiga, tsentrifuugimist, resuspendeerimist uues meediumis ja seejärel külvamist uuele plaadile. Üksikasjalikud sammud ja suhtarvud teiste anumate, näiteks 100 cm^2 kolbide ja 150 mm plaatide puhul, leiate algsest allikast.
HEK293 rakuliini eelised ja piirangud
HEK293 rakkudel on erilised omadused, mis muudavad need atraktiivseks teadusuuringuteks ja valkude tootmiseks.
Eelised
- Suur rekombinantse valgu tootmine: HEK293 rakud suudavad toota suures koguses rekombinantseid valke, millel on keerulised posttranslatiivsed modifikatsioonid.
- Paindlik transfektsioon: Need rakud on transfektsiooniuuringute jaoks väga tõhusad ja neid saab tõhusalt transfekteerida erinevate füüsikaliste ja keemiliste meetoditega.
- Geeniekspressiooni analüüs: HEK293 rakke saab tänu nende tõhusale transfekteerimisvõimele kasutada nii mööduvaks kui ka stabiilseks geeniekspressiooni analüüsiks.
- Tulemuste reprodutseeritavus: HEK293 rakud pakuvad järjepidevaid, usaldusväärseid ja korratavaid tulemusi, mistõttu on nad uurimislaboratooriumides populaarne valik.
HEK293 rakuliini puudused
- Bakteriaalne saastumine: Bakteriaalse saastumise oht on rakuliinide, sealhulgas HEK293 rakkude kultiveerimisel tavaline probleem. Bakteriaalsed nakkused võivad muuta kultiveerimismediumi pH-d, põhjustada hägusust ning mõjutada rakkude kuju, kasvatusperioodi ja geeniekspressiooni. Saastumise vältimiseks tuleb rangelt järgida aseptilisi rakukultuuride kasvatamistingimusi.
- Viirusnakkus: HEK293 rakud, nagu ka teised inimese rakuliinid, on vastuvõtlikud inimese viirushaigustele. Neid infektsioone on võimalik tuvastada ainult PCR-testide abil ja need ei ole kergesti nähtavad.
- Kultuuriperiood: Kuigi HEK293 rakuliin on immortaliseeritud, võivad pikad kultuuriperioodid järk-järgult kahjustada rakkude tervist ning mõjutada geeniekspressiooni, reprodutseeritavust ja rakkude kasvu. Terve kultuuri säilitamiseks on soovitatav hoida läbikäikude arv alla 20.
HEK293 ressursside ülevaade: Protokollid, videod ja muud andmed
HEK293 rakud on laialdaselt kasutatav ja hästi uuritud rakuliin, mille tõttu on nende hooldamiseks ja kasvatamiseks olemas mitmesugused ressursid. Siinkohal toome välja mõned ressursid HEK293 rakukultuuriprotokollide tundmaõppimiseks:
- HEK rakkude jagamine ja hooldamine: HEK293 rakkude kohta rohkelt teavet sisaldav hariv veebileht. Selles kirjeldatakse selle rakuliini subkultiveerimise ja külvamise protokolli.
- HEK293 rakud: See veebisaidi link annab kogu avaldatud teabe rakkude kultiveerimistingimuste, kasvukeskkonna ja jagamisprotokollide kohta.
HEK293 rakuliiniga seotud videod
HEK293 rakkude subkultiveerimise, rakkude paljundamise ja transfektsiooni protokollide kohta on kergesti kättesaadavad mitmed õppevideod.
- Transientne ekspressioon 293 rakkude abil: Selles õppevideos kirjeldatakse koos illustratsioonidega transientse ekspressiooni analüüsi põhikontseptsiooni HEK293 rakkudes.
- HEK293 rakkude jagamine: See video näitab HEK293 rakuliini täielikku subkultiveerimisprotokolli.
Avage oma teadusuuringute potentsiaal HEK293 rakkudega! Meil on olemas kogu teave, mida vajate alustamiseks, nii et miks peaksite ootama? Tehke arukas valik ja tellige meilt juba täna, et kogeda selle uskumatu rakuliini kasutamise eeliseid oma uuringus!
Korduma kippuvad küsimused HEK293 rakkude kohta
HEK293 rakke kasutatakse teaduslikes uuringutes laialdaselt, mis loomulikult tekitab arvukalt küsimusi nende olemuse, päritolu ja omaduste kohta. Järgnevalt uurime mõningaid neist sagedastest küsimustest.
Viiteluetelu
- Lin, Y.-C., et al., Inimese embrüonaalse neeru 293 liini genoomi dünaamika vastusena rakubioloogilistele manipulatsioonidele. Nature communications, 2014. 5(1): p. 4767.
- Tan, E., et al., HEK293 rakuliin kui platvorm rekombinantsete valkude ja viirusvektorite tootmiseks. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 2021: p. 1288.
- Pulix, M., et al., HEK293 rakkude kui uute mitmekülgsete rakufaktuuride molekulaarne iseloomustamine. Current Opinion in Biotechnology, 2021. 71: p. 18-24.
- Alvim, R.G., I. Itabaiana Jr ja L.R. Castilho, Zika viiruse sarnased osakesed (VLP): Stabiilsed rakuliinid ja pideva perfusiooni protsessid kui uus potentsiaalne vaktsiini tootmisplatvorm. Vaccine, 2019. 37(47): p. 6970-6977.
- Schwarz, H., et al., Väikesemõõtmeline bioreaktor toetab suure tihedusega HEK293 rakkude perfusioonikultuuri rekombinantse erütropoetiini tootmiseks. Journal of biotechnology, 2020. 309: p. 44-52.
- Liu, X., et al., Hõbeda nanoosakeste nanotoksiline mõju normaalsetele HEK-293 rakkudele võrreldes vähirakkude HeLa rakuliiniga. International journal of nanomedicine, 2021. 16: p. 753.
- Patra, B., et al., Piper betle: kulla nanoosakeste tõhustatud süntees ja selle in vitro tsütotoksilisuse hindamine HeLa ja HEK293 rakkudel. Journal of Cluster Science, 2020. 31: p. 133-145.
- Stepanenko, A. ja V. Dmitrenko, HEK293 rakubioloogias ja vähiuuringutes: fenotüüp, karyotüüp, kasvajate teke ja stressi poolt põhjustatud genoomi-fenotüübi evolutsioon. Gene, 2015. 569(2): p. 182-190.