HEK rakupõhised suure läbilaskevõimega GPCRi skriiningplatvormid

G-valguga seotud retseptorid (GPCR) esindavad inimgenoomi suurimat membraanvalkude perekonda ja moodustavad ligikaudu 34% kõigist ravimite sihtmärkidest. Cytion mõistab, et tõhusate GPCR-ile suunatud ravimite väljatöötamiseks on vaja tugevaid rakupõhiseid sõeluuringuplatvorme, mis suudavad täpselt mõõta retseptori aktiveerimist tuhandete kuni miljonite ühendite puhul. HEK293 rakud on kujunenud eelistatud peremeheks GPCRi ekspressiooni ja funktsionaalse skriiningu jaoks, pakkudes ainulaadset kombinatsiooni tõhusast retseptori ekspressioonist, madalast endogeensest retseptori taustast ja ühilduvusest erinevate testivormidega.

Peamised järeldused

• HEK293 rakud pakuvad ideaalset tausta heteroloogilise GPCRi ekspressiooniks, kus endogeensed retseptorid häirivad minimaalselt
• Mitu katsevormingut - kaltsiumivool, cAMP, β-arrestiini värbamine - võimaldavad terviklikku uurimist
• Automaatne vedeliku käitlemine ja plaadilugejad võimaldavad skriiningu läbilaskevõimet, mis ületab 100 000 ühendit päevas
• Stabiilsed rakuliinide arendamise strateegiad tasakaalustavad läbilaskevõime nõudeid ja katsete järjepidevust
• Ebaõige agonismi tuvastamine nõuab mitmekordseid lugemisi erinevate signaalkaskadide lõikes

Miks HEK293 rakud on GPCRi skriiningus suurepärased

HEK293 rakud on muutunud GPCRi funktsionaalsete testide de facto standardiks mitmete eeliste tõttu. Esiteks, nende suhteliselt madal endogeenne GPCR-i ekspressioon vähendab taustsignaali, mis võib segada heteroloogiliste retseptorite uuringuid. Erinevalt teatavatest vähist saadud rakuliinidest, mis ekspresseerivad arvukaid GPCR-e funktsionaalselt asjakohasel tasemel, pakuvad HEK293 rakud retseptori ekspressiooni jaoks puhast lõuendit.

Teiseks, HEK293 rakud ekspresseerivad kõiki peamisi G-valkude alamkategooriaid (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) piisaval tasemel, et toetada erinevaid retseptorite sidumisi. Selline täielik signaalirepertuaar võimaldab uurida natiivseid retseptori ja valgu vastastikmõjusid, ilma et oleks vaja spetsiifiliste G-valgu allüksuste kaasekspressiooni.

Kolmandaks, HEK293 rakud transfekteeruvad tõhusalt mitme reaktiiviklassi abil, saavutades transfektsiooni määrad, mis ületavad 90%. See tõhusus tähendab kõrget retseptori ekspressiooni taset - tüüpiliselt 10⁵ kuni 10⁶ retseptorit raku kohta -, mis tagab tugeva signaaliakna isegi tagasihoidliku sidumistõhususega retseptorite puhul.

Meie HEK293T rakud (300189 ) pakuvad eriti kõrget transfektsiooni tõhusust mööduvaks GPCR-i ekspressiooniks, mistõttu on need ideaalsed retseptorite esialgseks iseloomustamiseks ja katsete arendamiseks enne stabiilse rakuliini loomiseks kohustumist.

Analüüsivormi valik GPCRi sõelumiseks

Kaltsiumivoo analüüsid: Gαq-ühendusega retseptorid aktiveerivad fosfolipaas C, mis vallandab kaltsiumi vabanemise rakusisestest varudest. Kaltsiumitundlikud fluorestseeruvad värvained, nagu Fluo-4, Fura-2 või geneetiliselt kodeeritud kaltsiumindikaatorid, võimaldavad seda reaktsiooni mõõta reaalajas. Plaadipõhised fluorestsentslugejad, nagu FLIPR, võivad samaaegselt mõõta kaltsiumimuutusi tervetel 384- või 1536-kujulistel plaatidel, saavutades läbilaskevõime, mis ületab 100 000 andmepunkti ööpäevas.

cAMP-analüüsid: Gαs-ühendusega retseptorid stimuleerivad adenülitsüklaasi, suurendades rakusisest cAMPi, samas kui Gαi-ühendusega retseptorid pärsivad cAMPi tootmist. Mitmed analüüsitehnoloogiad tuvastavad cAMPi muutusi, sealhulgas konkureerivad immunoloogilised analüüsid (HTRF, AlphaScreen), biosensoril põhinevad meetodid (GloSensor) ja reportergeenide analüüsid (CRE-luciferaas). Kõik pakuvad erinevaid eeliseid tundlikkuse, kineetika ja läbilaskevõime osas.

β-arrestiini värbamine: GPCR-i aktiveerimine käivitab β-arrestiini värbamise retseptorile, mis on mõõdetav valgu komplementatsioonianalüüside abil. Sellised tehnoloogiad nagu PathHunter (ensüümifragmentide komplementeerimine) ja NanoBiT (jagatud luciferaas) pakuvad tundlikke, teest sõltumatuid mõõtmisi, mis on kohaldatavad kõigis retseptoriklassides, sõltumata G-valgu sidumise eelistustest.

Reportergeenide analüüsid: Transkriptsioonilised reporterisüsteemid mõõdavad allavoolu signaalisündmusi, pakkudes võimendamist, mis suurendab tundlikkust. CRE-luciferaasi reporterid tuvastavad cAMP-radade aktiveerimist, NFAT-luciferaas reageerib kaltsiumi signalisatsioonile ja SRE-luciferaas jälgib mitmeid radasid. Kuigi need on aeglasemad kui otsesed teise sõnumitooja mõõtmised, annavad reporteranalüüsid suurepärase signaali ja tausta suhte.

Stabiilsete rakuliinide arendamise strateegiad

Suure läbilaskevõimega sõelumiskampaaniad nõuavad tavaliselt stabiilseid rakuliine, mis ekspresseerivad sihtgruppi GPCR-i ühtlaselt miljardites katsekaevudes. Stabiilse rakuliini arendamine algab vektori disainiga, mis sisaldab nii retseptorit kui ka selekteeritavat markerit, võimaldades stabiilselt transfekteeritud rakkude rikastamist.

Meie HEK293 rakud (300192 ) on stabiilse rakuliini loomise standardne vanemliin. Pärast transfektsiooni ja antibiootikumide selektsiooni (tavaliselt 2-4 nädalat) toimub ellujäänud rakkude kloonimine ühe raku kaupa piirhulga lahjendamise või fluorestsentsiga aktiveeritud rakkude sorteerimise (FACS) abil. Seejärel laiendatakse ja iseloomustatakse üksikuid klone retseptori ekspressiooni taseme, funktsionaalse reaktsiooni ulatuse ja analüüsi usaldusväärsuse osas.

Kriitilised kvaliteedinäitajad rakuliinide sõelumisel on ekspressiooni stabiilsus pikema aja jooksul, järjepidev farmakoloogia võrreldes võrdlusstandarditega ja tugev toimimine miniatuursete plaatide formaadis. Kvalifitseeritud rakkude pangad tuleks luua sõelumiskampaania alguses, et tagada järjepidev toimivus kogu sõelumiskampaania vältel.

Kiirendatud tähtaegade puhul võimaldavad meie HEK293 EBNA rakud (300264 ) stabiilset ekspressiooni episomaalsetest vektoritest, mis võib lühendada arendusaega, säilitades samal ajal ekspressiooni järjepidevuse.

Miniatuursuse ja automatiseerimise kaalutlused

Sõelumisläbivuse maksimeerimine nõuab miniatuursust 384-kujulise, 1536-kujulise või isegi 3456-kujulise formaadini. HEK293 rakud kohanevad hästi suure tihedusega plaatimistega vähendatud mahus, kuigi iga formaadi ülemineku puhul võib olla vaja optimeerida rakutihedust, plaatimistingimusi ja inkubatsiooniaegu.

Suspensioniga kohandatud HEK293 rakud pakuvad eeliseid automatiseeritud sõelumisprotsesside jaoks. Meie HEK293 suspensiooniga adapteeritud rakke (300686 ) saab doseerida otse kultuuranumatest prooviplaatidesse ilma trüpsiinistamiseta, vähendades käitlemisetappe ja parandades järjepidevust. Selline ühilduvus automatiseeritud vedelikukäitlejatega võimaldab tõelisi walkaway skriiningkampaaniaid.

Testplaatide stabiilsusnõuded on formaaditi erinevad. Kaltsiumivoo analüüsid nõuavad tavaliselt mõõtmist mõne tunni jooksul pärast värvaine laadimist, samas kui cAMP ja β-arrestiini analüüsid võivad lubada inkubeerimist üleöö enne lugemist. Nende piirangute mõistmine aitab kaasa sõelumislogistikale ja seadmete planeerimisele.

Andmete analüüs ja tabamuse tuvastamine

GPCRi skriiningukampaaniad tekitavad tohutuid andmekogumeid, mis nõuavad kindlaid analüüsipipeleid. Statistilised parameetrid, sealhulgas Z-faktor, signaali ja tausta suhe ning variatsioonikordaja, hindavad analüüsi kvaliteeti plaaditi. Plaate, mille kvaliteediläved ei ole täidetud, tuleks pigem korrata kui analüüsida.

Osumite tuvastamise kriteeriumid tasakaalustavad tundlikkuse ja valepositiivsete tulemuste määra. Aktiivsuse künnised 50% aktiveerimise või inhibeerimise kohta võrreldes võrdlusühenditega on mõistlikud lähtepunktid, kuigi optimaalsed piirväärtused sõltuvad raamatukogu koostisest ja programmi eesmärkidest. Esmaste tabamuste kontsentratsioonivastuse kinnitamine välistab artefaktid ja järjestab ühendid järelkontrolliks.

Kaasaegne GPCR-ravimite avastamine rõhutab üha enam kallutatud agonismi - ühendid, mis eelistavad teatud signaaliradu teistele. Ebaõigete ühendite avastamiseks on vaja paralleelseid teste, mis mõõdavad mitut teed (nt G-valgu aktiveerimine versus β-arrestiini värbamine), pöörates hoolikalt tähelepanu testide tundlikkusele ja kineetikale, et vältida tehnilisi eelarvamusi.

Soovitatavad tooted GPCRi sõelumiseks:

• HEK293T rakud (300189) - kõrge efektiivsusega mööduv ekspressioon
• HEK293 rakud (300192) - stabiilse rakuliini loomine
• HEK293 suspensiooniga adapteeritud (300686 ) - automatiseeritud skriiningtööprotsessid
• HEK293 EBNA rakud (300264) - kiirendatud stabiilse rakuliini arendamine
• DMEM High Glucose (820300a) - standardkultuurikeskkond