CRISPR sõelumine rakuliinides: Genoomi-ülene funktsionaalne analüüs

CRISPR-Cas9 tehnoloogia on muutnud funktsionaalse genoomika revolutsiooniliseks, võimaldades süstemaatiliselt uurida geenide funktsiooni kogu genoomi ulatuses kultiveeritud rakkudes. Cytionis tunnistame, et meie rakud ja rakuliinid on võimsad platvormid CRISPR-skriiningu rakenduste jaoks, mis tuvastavad erinevaid rakuprotsesse, alates proliferatsioonist kuni ravimiresistentsuseni, kontrollivaid geene. Poolitud CRISPR-skriinidega viiakse rakupopulatsioonidesse raamatukogud, mis sisaldavad tuhandeid kuni sadu tuhandeid juhtrNAsid (sgRNAsid), luues massilisi kogumikke, kus iga rakk saab erineva geneetilise häire. Rakendades selektiivset survet ja jälgides, millised sgRNAd rikastuvad või kahanevad, tuvastavad teadlased süstemaatiliselt ellujäämiseks olulisi geene, ravimi suhtes resistentsust andvaid geene või mis tahes selekteeritavat fenotüüpi reguleerivaid geene. Selline erapooletu funktsionaalne genoomika on kiirendanud avastusi vähibioloogia, immunoloogia, nakkushaiguste ja rakubioloogia aluste vallas, muutes kultiveeritud rakud süstemaatiliste bioloogiliste avastuste mootoriteks.

CRISPR raamatukogu disain ja tarnimine

Genoomi ulatusega CRISPR-raamatukogud sisaldavad sgRNA järjestusi, mis on suunatud igale valku kodeerivale geenile genoomis, tavaliselt 4-10 juhti geeni kohta, et tagada tugev katvus ja võtta arvesse juhti muutuvat tõhusust. Inimese genoomi hõlmavad raamatukogud sisaldavad 70 000-100 000 sgRNA järjestust, samas kui keskendunud raamatukogud, mis on suunatud alamrühmadele, nagu kinaasid, epigeneetilised regulaatorid või metaboolsed ensüümid, võimaldavad sügavamat katvust väiksema koguhulgaga konstruktsioonidega. Raamatukogu kvaliteet mõjutab kriitiliselt sõelumise edukust - juhendid peavad tõhusalt esile kutsuma knockout'i, vältides samal ajal sihtmärgivälist mõju, mis segab interpreteerimist.

Lentsviiruse kasutamine on endiselt standard sgRNA raamatukogude viimiseks rakupopulatsioonidesse. Kogu sgRNA raamatukogu sisaldav koondatud lentiviirus nakatab rakke madala infektsioonikordaja (MOI) juures, tavaliselt 0,3-0,5, tagades, et enamik nakatatud rakke saab ainult ühe sgRNA konstruktsiooni. See nõue, et iga raku kohta on ainult üks häire, hoiab ära segaduse, mis tuleneb mitmete knockoutidega rakkudest. Pärast transduktsiooni kõrvaldatakse antibiootikumide abil nakatumata rakud, mille tulemuseks on populatsioonid, kus iga rakk kannab kindlat geneetilist häireid. Cytioni rakuliinide puhul on transduktsiooni tõhusus rakutüübiti erinev - suspensioonirakud transdutseeruvad sageli tõhusalt, samas kui mõned adherentsed liinid nõuavad viiruskontsentratsiooni, polübreeni ja spinokulatsiooni optimeerimist.

Raamatukogu esindatus - iga sgRNA-d sisaldavate rakkude arv - mõjutab kriitiliselt sõelumise kvaliteeti. Kogu genoomi hõlmavate skriinide puhul on vaja säilitada kogu katse jooksul 500-1000 rakku sgRNA kohta, et vältida juhusliku proovivõtu efektidest tulenevat juhiste stohhastilist kadumist. 100 000 sgRNA raamatukogu puhul nõuab see 50-100 miljoni raku stardipopulatsiooni ning proportsionaalse arvu säilitamist valiku ja passageerimise kaudu. Ebapiisav esindatus tekitab müra, mis varjutab tegelikke tabamusi ja tekitab juhuslikust väljalangemisest tulenevaid valepositiivseid tulemusi.

Negatiivse valiku sõelad: Oluliste geenide tuvastamine

Negatiivse selektsiooni sõeluuringuga tuvastatakse geenid, mis on vajalikud rakkude ellujäämiseks või paljunemiseks standardkultuuritingimustes. Rakud transdutseeritakse sgRNA raamatukogudega, valitakse integratsiooni jaoks, seejärel passageeritakse neid pidevalt 2-4 nädala jooksul, säilitades samal ajal raamatukogu esindatuse. Oluliste geenide vastu suunatud sgRNAd ammenduvad, kuna rakud, mis sisaldavad neid knockoute, ei paljune või surevad. Võrreldes sgRNA-de arvukust lõpptähtajal võrreldes algpopulatsiooniga (T0), selgub, millised geenid on katsetes sobivuse saavutamiseks vajalikud.

Oluliste geenide skriinid loovad rakuliinispetsiifilisi sõltuvuskaarte, mis paljastavad terapeutilise sekkumise jaoks kasutatavaid haavatavusi. Vähirakuliinid sõltuvad sageli onkogeenidest või rakuradade komponentidest, mida normaalsed rakud ei nõua, mis kujutavad endast potentsiaalseid terapeutilisi sihtmärke. Näiteks HeLa rakkudel on iseloomulikud sõltuvused geenidest, mis toetavad kiiret proliferatsiooni ja genoomse ebastabiilsuse juhtimist. Vähi sõltuvuskaardi projektis on läbi viidud kogu genoomi hõlmav CRISPR-skriining sadades vähirakuliinides, kataloogides geneetilisi sõltuvusi ja seostades neid genoomiliste omadustega, et ennustada patsiendispetsiifilisi haavatavusi.

Kontekstispetsiifilised essentsiaalsuse sõelad võrdlevad geenisõltuvusi erinevates tingimustes või rakuliinides. Paralleelsete sõeluuringute läbiviimine normaalsetes ja transformeerunud rakkudes või erineva geneetilise taustaga rakkudes võimaldab tuvastada sünteetilisi letaalseid koostoimeid, mille puhul geenikaotus osutub letaalseks ainult konkreetsetes kontekstides. Need kontekstispetsiifilised sõltuvused pakuvad terapeutilisi aknaid - vähktõve puhul oluliste, kuid normaalsetes kudedes tarbetute geenide sihtmärgiks võtmine vähendab toksilisust. Erinevat koepäritolu ja transformeerumise seisundit esindavate Cytioni rakuliinide puhul kaardistab võrdlev CRISPR-skriining rakusisalduste geneetilise arhitektuuri.

Positiivse valiku sõelad: Resistentsuse ja ellujäämise mehhanismid

Positiivse selektsiooni sõeludes rakendatakse selektiivset survet, mis tapab enamiku rakke, rikastades ellujäämist või resistentsust andvaid sgRNAsid. Ravimiresistentsuse skriinid ravivad raamatukogu-infektsiooniga rakke terapeutikumidega kontsentratsioonides, mis tapavad muundamata rakke. Ellujäänud rakud on rikastatud sgRNAdega, mis häirivad ravimi sihtmärke, aktiveerivad resistentsusradasid või blokeerivad pro-apoptootilist signalisatsiooni. Nende geenide tuvastamine paljastab ravimite toimemehhanismid ja võimalikud resistentsusmehhanismid, mis võivad kliiniliselt esile kerkida.

Toksiiniresistentsuse skriininguga tuvastatakse geenid, mis on vajalikud toksiini omastamiseks, aktiveerimiseks või tsütotoksiliseks toimimiseks. Näiteks difteeriatoksiiniga skriining rikastab sgRNAsid, mis on suunatud toksiini retseptorile ja toksiini sisenemiseks vajalikele membraani liikumiskomponentidele. Patogeeni tundlikkuse skriinid seavad rakud viiruste või bakteriaalsete toksiinidega kokku, tuvastades infektsiooniks olulisi peremeesfaktoreid. Need sõelad on kaardistanud patogeenide poolt ära kasutatud rakumehhanismid, paljastades potentsiaalsed terapeutilised sihtmärgid nakkuse blokeerimiseks.

Kasvufaktoritest sõltumatuse sõeludes kasvatatakse rakke vähendatud seerumis või spetsiifilise kasvufaktori äravõtmisel, tuvastades geenid, mille häirimine võimaldab kasvufaktorist sõltumatut paljunemist. Need tabamused on sageli kasvaja supressorid või kasvu signaaliradade negatiivsed regulaatorid. Kasvufaktorist sõltumatust võimaldavate radade mõistmine valgustab vähi progresseerumise mehhanisme ja tuvastab potentsiaalsed sihtmärgid kombineeritud ravimeetodite jaoks, mis takistavad resistentsuse tekkimist.

FACS-põhised CRISPR-varjundid

Fluorestsentsiga aktiveeritud rakkude sorteerimine võimaldab sõeluda geenide järele, mis reguleerivad mis tahes fluorestsentsiga mõõdetavat fenotüüpi. Huvipakkuva tee kontrolli all fluorestseerivat reporterit ekspresseerivad rakud transdutseeritakse sgRNA raamatukogudega ja seejärel sorteeritakse reporteri ekspressiooni alusel. Kõrge ja madala reporteri ekspressiooniga rakud kogutakse eraldi ja sgRNA-de arvukust võrreldakse populatsioonide vahel. Rikastatud sgRNAdega tuvastatakse positiivsed regulaatorid (rikastatud madala ekspressiooniga populatsioonis, kui need on välja lülitatud) ja negatiivsed regulaatorid (rikastatud kõrge ekspressiooniga populatsioonis, kui need on häiritud).

Pinnamarkerite sõeludes sorteeritakse rakud rakupinnavalkude antikehade värvimise alusel. Need sõelad tuvastavad antigeenide esitlemise regulaatorid, immuunsüsteemi kontrollpunkti ligandid või adhesioonimolekulid. Immunoteraapia arendamiseks on FACS-põhiste sõeluuringute abil tuvastatud PD-L1 ekspressiooni kontrollivad geenid, paljastades sihtrada, mis võivad suurendada immuunravivastust. Võimalus sorteerida endogeense valgu ekspressiooni alusel, mitte insener-tehnoloogiliste reporterite alusel, laiendab sõelumise ulatust mis tahes valkudele, millel on sobivad antikehad.

Multiparameetriline FACS võimaldab keerukat fenotüüpset eristamist. Mitme markeri samaaegne mõõtmine tuvastab geenid, mis mõjutavad spetsiifiliselt teatavaid rakupopulatsioone või -seisundeid. Näiteks sorteerimine suuruse ja granulaarsuse alusel koos elujõulisuse värvainetega eristab apoptootilisi rakke tervetest, võimaldades apoptoosi reguleerivate rakkude sõelumist. Peamine piirang on endiselt läbilaskevõime - FACS-põhised sõelad nõuavad rohkem rakke kui lihtne ellujäämisvalik ja seisavad silmitsi praktiliste piirangutega, kui palju rakke saab sorteerida, mis võib piirata raamatukogu suurust või esindatust.

Pildipõhised CRISPR-varjundid

Automatiseeritud mikroskoopia koos pildianalüüsiga võimaldab skriinida morfoloogilisi fenotüüpe, mis ei ole FACSi jaoks kättesaadavad. Rakud, mis on nakatatud massiivi sgRNA raamatukogudega (üks või paar juhti kaevu kohta), fikseeritakse ja pildistatakse, ekstraheerides sadu morfoloogilisi tunnuseid raku kohta. Masinõpe klassifitseerib fenotüübid, tuvastades juhendid, mis põhjustavad iseloomulikke morfoloogilisi muutusi. Erinevalt ühendatud ekraanidest säilitavad massiiviformaadid häirete ruumilise eraldatuse, võimaldades mikroskoopial põhinevaid lugemisi.

Organellide morfoloogia sõeludes tuvastatakse geene, mis reguleerivad mitokondriaalseid võrgustikke, Golgi struktuuri, tuuma morfoloogiat või tsütoskeleti korraldust. Need ekraanid on paljastanud organellide funktsiooni säilitavaid kvaliteedikontrollimehhanisme ja tuvastanud organellide dünaamikat ja rakutsükli kulgu koordineerivaid geene. Hästi iseloomustatud morfoloogiaga tsütoloogiliste rakuliinide puhul võib pildipõhine skriining tuvastada peeneid fenotüüpe, mis ei ole muudele näitajatele nähtavad.

Elusrakkude pildistamise ekraanid jälgivad dünaamilisi protsesse, nagu rakkude jagunemine, ränne või kaltsiumisignaalide edastamine aja jooksul. Massiivsete knockoutide aegluubis kuvamine paljastab geenid, mis kontrollivad jagunemise ajastust, mitootilise spindli orientatsiooni või migratsiooni kiirust ja suunitlust. Pildistamise andmete rikkalikkus on seotud läbilaskevõime hindadega - massiividega ekraanid uurivad vähem häireid kui koondatud ekraanid, kuigi konkreetsetele geeniperekondadele suunatud raamatukogud tasakaalustavad katvust ja praktilisi piiranguid.

Analüüs ja tabamuse valideerimine

Pärast valimist ja proovide kogumist ekstraheeritakse genoomne DNA ja sgRNA piirkond amplifitseeritakse PCR abil praimerite abil, mis sisaldavad sekveneerimisadaptereid. Sügav sekveneerimine kvantifitseerib iga sgRNA arvukuse, tekitades lugemissageduse, mida võrreldakse katse- ja kontrollproovide vahel. Arvutivahendid nagu MAGeCK, BAGEL või JACKS hindavad statistiliselt rikastumist või kahanemist, võttes arvesse tuhandete geenide mitmekordset hüpoteeside testimist.

Kõrge tõenäosusega tabamused näitavad järjepidevat mõju mitme sõltumatu sgRNA puhul, mis on suunatud samale geenile. Geenid, mille puhul ainult üks või kaks juhti näitavad mõju, kujutavad endast tõenäoliselt pigem sihtmärgivälist artefakti kui tõelist tabamust. Statistilised meetodid koondavad tõendusmaterjali kõigi suunajate kohta geeni kohta, suurendades tõeliste positiivsete tulemuste tuvastamise võimsust ja vähendades samal ajal üksikutest suunajatest tulenevaid valearusaamu. Kontrolljuhid, mis on suunatud teadaolevalt olulistele geenidele või mittesihtotstarbelistele kontrollidele, valideerivad ekraani tulemuslikkust ja kalibreerivad statistilisi lävendeid.

Valideerimiskatsed kinnitavad sõeltestide tabamust, kasutades sõltumatuid sgRNAsid või ortogonaalseid knockout-meetodeid. Üksikud sgRNAd kloonitakse ja katsetatakse sõeluuringu rakuliinis ja ideaaljuhul täiendavates rakuliinides, et hinnata reprodutseeritavust ja üldistatavust. Sihtgeeni reekspresseerimise katsed, mille käigus ekspresseeritakse sihtgeeni uuesti cDNAst, millel puudub sgRNA sihtjärjestus, kinnitavad sihtmärgile suunatud mõju. Terapeutilise sihtmärgi valideerimiseks testitakse tabamusi Cytion rakuliinide paneelides, mis esindavad erinevaid geneetilisi taustu, et tuvastada laialt kohaldatavad ja mitte kontekstispetsiifilised sõltuvused.

Variandid ja täiustatud sõelumismeetodid

CRISPRi ja CRISPRa sõeludes kasutatakse katalüütiliselt surnud Cas9-i, mis on fikseeritud transkriptsiooni repressorite või aktivaatoritega, võimaldades pigem pöörduvat geenide knockdown'i või aktiveerimist kui püsivat knockout'i. Need lähenemisviisid väldivad täieliku geenikaotuse tekitatud segadust, modelleerivad geeniekspressiooni muutusi, mitte nullmutatsioone, ja võimaldavad skriinida mitteproteiini kodeerivaid regulatiivseid elemente. Oluliste geenide puhul, mille koputus põhjustab letaalsust, võib CRISPRi osaline koputamine näidata annusest sõltuvaid fenotüüpe ja terapeutilisi aknaid.

Baasredaktsiooniga skriinid viivad sissepanekute/lõikamiste asemel sisse täpseid punktmutatsioone, võimaldades valgu domeenide või regulatiivsete elementide süstemaatilist mutageneesi. Peamised redigeerimisekraanid lubavad veelgi suuremat täpsust, viies sisse või parandades spetsiifilisi mutatsioone. Need järgmise põlvkonna ekraanid võimaldavad süstemaatiliselt analüüsida valkude struktuuri ja funktsiooni vahelisi seoseid ning uurida haigusega seotud variante mastaabis.

Kombinatoorne skriining, milles kasutatakse kahe sgRNA raamatukogusid, testib süstemaatiliselt geenipaare, tuvastades geneetilisi interaktsioone, sealhulgas sünteetilist letaalsust, supressiooni ja epistaasi. Kuigi tehniliselt on see keeruline, kuna raamatukogu keerukus suureneb faktoriaalselt, kaardistavad kombinaatorilised ekraanid geneetilisi võrgustikke ja tuvastavad kombineeritud ravistrateegiaid. Fookustatud kombinaatorilised sõelad, mis on suunatud ravimit võimaldavatele geenipaaridele, näitavad kombinatsiooniteraapiaid, mis võivad vältida resistentsust või suurendada tõhusust võrreldes üheainsa ravimeetodiga.

Rakendused ravimite avastamisel ja arendamisel

CRISPR-ekraanid kiirendavad sihtmärkide tuvastamist, katsetades süstemaatiliselt, milliste geenide häirimisel tekivad soovitud terapeutilised fenotüübid. Vähisõltuvuse skriinid tuvastavad vähirakkudes olulised geenid, mis kujutavad endast potentsiaalseid terapeutilisi sihtmärke. Patsiendist saadud rakkude või isogeensete rakuliinide paneelide sõeluuringud stratifitseerivad sihtmärke geneetilise konteksti alusel, võimaldades täppismeditsiini lähenemisviise, mis sobitavad ravimeetodid patsiendi biomarkeritega.

Tundmatute sihtmärkidega ühendite toimemehhanismi uuringutes kasutatakse CRISPR-ekraane, et tuvastada resistentsust või tundlikkust põhjustavaid geene. Kui konkreetse geeni häirimine põhjustab resistentsust ühendi suhtes, kodeerib see geen tõenäoliselt ravimi toimimiseks vajalikku sihtmärki või raja komponenti. See lähenemisviis on selgitanud nii väljakujunenud kui ka uute ravimite mehhanisme, kiirendades kliinilist arendustegevust ja tuvastades biomarkereid patsientide valimiseks.

Resistentsusmehhanismide prognoosimise sõeludes töödeldakse rakke CRISPR-skriiningu ajal subletaalsete ravimidoosidega, tuvastades geenid, mille häirimine tekitab resistentsuse. Need geenid kujutavad endast potentsiaalseid mehhanisme, mille abil kasvajad võivad ravist kõrvale hiilida, võimaldades resistentsusradasid blokeerivate kombinatsioonistrateegiate väljatöötamist. Erinevaid vähitüüpe modelleerivate Cytion rakuliinide puhul aitab resistentsuse sõelumine kaasa kliiniliste uuringute kavandamisele ja patsientide jälgimisstrateegiatele.

Väljakutsed ja parimad tavad

Vaatamata täiustatud sgRNA kavandamise algoritmidele on endiselt probleemiks sihtmärgivälist mõju. Mõned suunajad lõhustavad soovimatuid genoomseid kohti, mille järjestus sarnaneb sihtmärgiga, põhjustades fenotüüpe, mis ei ole seotud kavandatud geenide häirimisega. Mitme sõltumatu juhi kasutamine geeni kohta ja juhte hõlmav statistiline koondamine leevendab seda probleemi. Parimate tabamuste valideerimine ortogonaalsete meetoditega kinnitab sihtmärgile suunatud mõju.

Ebatäielik või hilinenud knockout-kineetika võib mõjutada sõeluuringu tulemusi. Mõned sgRNAd lõikavad ebatõhusalt, tekitades pigem osalise kui täieliku knockout'i. Valgu stabiilsus tähendab, et DNA/RNA tasandil toimuv knockout nõuab aega, et olemasolev valk laguneks enne fenotüübi ilmnemist. Sõelumine peab kestma piisavalt kaua pärast valgu täielikku eemaldamist, tavaliselt 7-14 päeva, sõltuvalt sihtvalgu poolväärtusajast ja rakkude kahekordistumise ajast.

Sõelumise kvaliteedikontroll hõlmab raamatukogu esindatuse jälgimist, Cas9 aktiivsuse kinnitamist ja kontrolljuhtide oodatava käitumise valideerimist. Esialgsete populatsioonide sekveneerimine kinnitab raamatukogu keerukust ja esindatust. Teadaolevalt olulistele geenidele suunatud juhendid peaksid negatiivse selektsiooni sõeludes näitama tugevat kahanemist, samas kui mittesihtotstarbelised kontrollid ei tohiks oluliselt muutuda. Kõrvalekaldumine oodatavast kontrollkäitumisest viitab tehnilistele probleemidele, mis vajavad enne katsetulemuste tõlgendamist tõrkeotsingut.

Tulevased suunad ja laienevad rakendused

Perturb-seq ühendab CRISPR-skriiningu ühe raku RNA sekveneerimisega, mis võimaldab analüüsida transkriptoomilisi reaktsioone tuhandetele geneetilistele häiretele samaaegselt. See lähenemisviis kaardistab, kuidas geenihäired levivad läbi molekulaarsete võrgustike, paljastades regulatiivsed seosed ja radade arhitektuuri. Cytioni rakuliinide puhul pakuvad Perturb-seq andmekogumid põhjalikku funktsionaalset iseloomustust, mis täiendab traditsioonilisi sõeluuringuid.

In vivo CRISPR-skriining laiendab ühendatud skriiningut loomamudelitele, tuvastades geenid, mis kontrollivad kasvaja kasvu, metastaasi või immuunravivastust füsioloogiliselt asjakohastes kontekstides. Raamatukoguga infitseeritud rakud implanteeritakse hiirtele ja sgRNA kvantifitseerimiseks korjatakse kasvajaid. Kasvavates kasvajates rikastatud geenid esindavad in vivo sobivuse mõjureid, mis võivad jääda rakukultuuride sõeludes tähelepanuta. Need lähenemisviisid on sillaks rakuliiniuuringute ja kliinilise translatsiooni vahel.

Cytioni ja rakukultuuride kogukonna jaoks on CRISPR-skriining muutnud rakuliinid passiivsetest katsemudelitest aktiivseteks avastamismootoriteks. Kogu genoomi hõlmava sõeluuringu võimaldatav süstemaatiline funktsionaalne küsitlus avab jätkuvalt põhilisi bioloogilisi ja terapeutilisi võimalusi, muutes kultiveeritud rakud kaasaegsete bioloogiliste uuringute ja ravimite väljatöötamise asendamatuteks vahenditeks.