Primärzellen des Menschen

Was sind menschliche Primärzellen?

Primärzellen sind die reinste Form ihrer jeweiligen Gewebe. Sie werden aus dem Gewebe isoliert und so aufbereitet, dass sie sich unter idealen Bedingungen in einer Kultur ansiedeln können. Sie ahmen den Zustand in vivo genauer nach und weisen eine normale Physiologie auf, da sie aus Gewebe stammen und nicht modifiziert wurden. Aus diesem Grund können sie als nützliche Modelle für die Forschung in den Bereichen Zellpharmakologie, Toxikologie und Physiologie dienen (einschließlich Studien zum Stoffwechsel, zum Altern und zur Signaltransduktion). Beachten Sie, dass Primärzellen schwieriger zu kultivieren und zu erhalten sind als kontinuierliche Zelllinien, da sie eine kürzere Lebensdauer haben und nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen aufhören, sich zu teilen (oder seneszen). Untersuchungen zu zellulären Signalwegen werden durch die inhärente Variabilität von Primärzellen erschwert, die von Spendern gewonnen und durch Subkultivierungsverfahren weiterverarbeitet werden. Vor Beginn von Signalwegstudien führen Forscher häufig ein Screening durch, um festzustellen, ob die Zellen auf häufig verwendete Stimuli reagieren oder nicht. Um Zeit- und Geldverschwendung zu vermeiden, können Primärzellen vor dem Screening stimuliert werden, um wichtige Signalwege zu aktivieren.

Warum werden menschliche Primärzellen verwendet?

Immortalisierte Zelllinien werden häufig als Zellassay verwendet. Wissenschaftler haben jedoch erkannt, dass biologische Veränderungen aufgrund der Verwendung von Zelllinien bei der Untersuchung ihrer physiologischen Bedeutung nachteilig sein können. Die Verwendung von menschlichen Primärzellen verbessert den physiologischen Wert der durch Zellkulturen gewonnenen Daten, und sie werden zunehmend als wichtig für die Erforschung biologischer Prozesse, des Krankheitsverlaufs und der Arzneimittelentwicklung angesehen.

Menschliche Primärzellen finden breite Anwendung in In-vitro-Studien zur interzellulären und intrazellulären Kommunikation, in der Entwicklungsbiologie sowie bei der Erforschung der Mechanismen, die Krebs, der Parkinson-Krankheit und Diabetes zugrunde liegen, neben vielen anderen präklinischen und explorativen Bereichen der biologischen Forschung. Forscher nutzen seit langem immortalisierte Zelllinien, um Gewebefunktionen zu untersuchen; jedoch sind Zelllinien mit offensichtlichen Mutationen und Chromosomenanomalien möglicherweise keine guten Ersatzmodelle für normale Zellen und die Entstehung von Krankheiten im Frühstadium. Ein genaueres Modell eines bestimmten Gewebezelltyps lässt sich nun durch die Verwendung menschlicher Primärzellen erzielen, die aus diesem Gewebe isoliert und in Primärzellkulturmedien und -zusätzen gehalten werden.

Was ist eine Primärzellkultur?

Anstelle der Verwendung immortalisierter Zelllinien werden bei der Primärzellkultur Zellen direkt aus einem vielzelligen Organismus außerhalb des Körpers gezüchtet. In einigen Ländern, wie beispielsweise im Vereinigten Königreich, ist rechtlich anerkannt, dass Primärzellkulturen repräsentativer für in-vivo-Gewebe sind als Zelllinien. Dennoch benötigen Primärzellen das richtige Substrat und Nährstoffe, um zu wachsen, und nach einer bestimmten Anzahl von Teilungen entwickeln sie einen seneszenten Phänotyp, der dazu führt, dass sie sich dauerhaft nicht mehr teilen. Diese beiden Faktoren sind der Grund für die Erzeugung von Zelllinien. Sowohl natürlich immortalisierte Primärzellen (z. B. HeLa-Zellen) als auch künstlich immortalisierte Primärzellen (z. B. HEK-Zellen) können in Zellkulturen unbegrenzt gezüchtet werden.

Menschliche Primärzellen nach Gewebetypen

Epithelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten, Endothelzellen, Muskelzellen, Immunzellen und Stammzellen wie mesenchymale Stammzellen gehören zu den in der wissenschaftlichen Forschung am häufigsten verwendeten menschlichen Primärzellen. Zunächst sind die Kulturen heterogen (sie stellen eine Mischung der im Gewebe vorhandenen Zelltypen dar) und können in vitro nur für eine bestimmte Zeit am Leben erhalten werden. Die Transformation ist ein In-vitro-Prozess, der es ermöglicht, menschliche Primärzellen so zu manipulieren, dass sie unbegrenzt subkultiviert werden können. Die Transformation kann auf natürliche Weise erfolgen oder durch Chemikalien oder Viren induziert werden. Nach einer genetischen Transformation kann sich eine Primärkultur bei ausreichender Nährstoff- und Raumversorgung unbegrenzt teilen und zu einer immortalisierten Sekundärzelllinie werden.

Endothelzellen

Krebsbehandlung, Wundheilung, Forschung zur Zellsignalübertragung, Hochdurchsatz- und High-Content-Screening sowie toxikologisches Screening sind nur einige der Bereiche, die vom Einsatz primärer Endothelzellen als Forschungsinstrument profitieren können.

Keratinozyten

Keratinozyten, die aus der Epidermis entweder der Haut erwachsener Menschen oder der Vorhaut von Neugeborenen gewonnen werden, spielen eine entscheidende Rolle bei der Erforschung von Hauterkrankungen wie Psoriasis und Krebs.

Epithelzellen

Von Krebsstudien bis hin zu toxikologischen Untersuchungen haben sich primäre Epithelzellen als unschätzbare Ressourcen für die Modellierung der natürlichen Abwehrmechanismen des Körpers erwiesen.

Fibroblasten

Die Induktion pluripotenter Stammzellen (iPS-Zellen) und die Erforschung der Wundheilung sind nur einige der vielen Anwendungsmöglichkeiten für primäre Fibroblasten.

Immunzellen

Periphere mononukleäre Blutzellen, kurz PBMC, sind mononukleäre Zellen des Blutes mit einem runden Zellkern. Zu ihnen zählen vor allem Lymphozyten und Monozyten, die im Verlauf einer Immunantwort wichtige Funktionen übernehmen. Periphere mononukleäre Blutzellen werden häufig zur Diagnose von Infektionen oder zum Nachweis eines möglichen Impfschutzes eingesetzt. Ein Einblick in die durch T-Zellen vermittelte zelluläre Immunantwort ist dabei oft entscheidend.

Melanozyten

Melanozyten, die spezialisierten Hautzellen, die das Pigment Melanin produzieren, dienen als nützliche Modelle für die Forschung zu Themen wie Wundheilung, Toxizität, Melanom, der Reaktion der Haut auf ultraviolette (UV) Strahlung, Hauterkrankungen und Kosmetika.

Stammzellen

Stammzellen haben das Potenzial, sich in eine Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren. Aufgrund ihrer Differenzierungsfähigkeit bieten sie neue Möglichkeiten zur Modellierung von menschlichem Gewebe und Gesundheitszuständen.

Mesenchymale Stammzellen

Mesenchymale Stammzellen, auch als MSCs bekannt, können aus verschiedenen menschlichen Quellen wie Knochenmark, Fett (Fettgewebe), Nabelschnurgewebe (Wharton-Gelee) und Fruchtwasser (die den Fötus umgebende Flüssigkeit) gewonnen und in vitro vermehrt werden. Diese adulten Stromazellen besitzen die Fähigkeit, sich zu einer Vielzahl von Zelltypen zu entwickeln. Zu diesen Zelltypen gehören unter anderem Knochenzellen, Knorpelzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Hautzellen und Hornhautzellen.

Glatte Muskelzellen

In Hohlorganen säumen primäre glatte Muskelzellen (SMCs) die Innenwand und sorgen für die Kontraktilität. Neben Krebs und anderen Erkrankungen können SMCs zur Modellierung von Hypertonie und Fibrose verwendet werden.

Primärzellen und Zelllinien

Entweder durch spontane Mutation, wie bei transformierten Krebszelllinien, oder durch gezielte Veränderung, wie bei der künstlichen Erzeugung von Krebsgenen, haben kontinuierliche Zelllinien die Fähigkeit erlangt, sich endlos zu vermehren (immortalisiert). In der Regel sind kontinuierliche Zelllinien zuverlässiger und einfacher zu handhaben als Primärzellen. Sie lassen sich unbegrenzt vermehren und ermöglichen einen schnellen Zugriff auf wichtige Daten. Die Verwendung kontinuierlicher Zelllinien unterliegt bestimmten Einschränkungen, darunter die Tatsache, dass sie genetisch verändert bzw. transformiert sind, was zu einer Veränderung physiologischer Eigenschaften führen und nicht den In-vivo-Bedingungen entsprechen kann, sowie die Tatsache, dass sich diese Eigenschaften im Laufe der Zeit durch zahlreiche Passagierungen weiter verändern können.

Fortschritte in der Primärzellkultur

Primärzellen haben den Ruf, schwer zu handhaben zu sein. Dank der Entwicklungen in der Primärzellkultur, der Verfügbarkeit kommerzieller Primärzellen mit vollständig optimierten Protokollen und neuer Analysetechniken, die weniger Aufwand erfordern, wird der Prozess jedoch einfacher denn je.

Der Übergang von der zweidimensionalen zur dreidimensionalen Zellkultur gilt als wichtiger Meilenstein auf diesem Gebiet. Gewebespezifische Architektur, Zell-Zell-Interaktionen sowie mechanische und biochemische Signalwege können in einer 2D-Kultur abgeschwächt sein. Daher ist der biologische Wert dieser Kulturen begrenzt.

Andererseits ermöglicht die 3D-Zellkultur den Zellen, sich auszubreiten und mit einem dreidimensionalen extrazellulären Gerüst zu interagieren. Dadurch können die Zellen untereinander und mit der extrazellulären Matrix interagieren, was 3D-Kulturen physiologisch relevanter macht. Die Genauigkeit dieser Methode bei der Vorhersage von In-vivo-Reaktionen hat sie in Bereichen wie der Wirkstoffforschung und -entwicklung revolutionär gemacht. Aus diesem Grund bieten modernste Technologien wie aus Patienten gewonnene Organoide und „Organs-on-a-Chip“-Modelle hochgradig kontextbezogene Modelle für das Wirkstoffscreening und die Wirkstoffentwicklung.

Die Gewinnung von Primärzellen stellt einen Engpass in der Primärkultur dar. Um diesen zu überwinden, ist in der Regel ein größeres Gewebevolumen erforderlich, was jedoch schwer zu erreichen sein kann. Eine verbesserte analytische Empfindlichkeit bietet jedoch einen Weg nach vorn. So lässt sich beispielsweise der Bedarf an der Kultivierung großer Mengen an Primärzellen durch den Einsatz von Einzelzelltechnologie – darunter Sequenzierung, Western Blot und Massenzytometrie – verringern.

Vielversprechende Perspektiven für die Primärzellkultur

Die allgemeinen Schwierigkeiten der Primärzellkultur werden durch technologische Fortschritte gemildert. Im Gegenzug ersetzt diese Methode rasch andere Verfahren als Goldstandard in der zellulären und molekularen Biologie, sowohl in der Forschung als auch in der Praxis. Die Impfstoffherstellung, der Organersatz, Stammzelltherapien, die Krebsforschung und vieles mehr werden von den kontinuierlichen Fortschritten in der Primärzellkultur erheblich profitieren.

Tipps und Tricks zur Primärzellkultur

Anforderungen an die Zellvermehrung

Die beiden gängigsten Methoden zur Kultivierung von Primärzellen sind die Suspensionskultur und die Oberflächenkultur (2D). Einige Zellen sind in der Lage, frei im Blutkreislauf zu schweben, ohne sich jemals an einer Oberfläche anzuheften (zum Beispiel solche, die aus peripherem Blut stammen). Verschiedene Zelllinien wurden so entwickelt, dass sie in Suspensionskulturen gut gedeihen, wo sie Dichten erreichen können, die unter 2D-Wachstumsbedingungen unerreichbar sind. Primärzellen, die eine Verankerung benötigen, um in vitro zu wachsen, werden als adhärente Zellen bezeichnet; dazu gehören auch solche, die in festen Geweben vorkommen. Um die Adhäsionseigenschaften zu verbessern und weitere für Wachstum und Differenzierung erforderliche Signale bereitzustellen, werden diese Zellen in der Regel in einem flachen, unbeschichteten Kunststoffgefäß kultiviert, gelegentlich jedoch auch auf einem Mikroträger. Letzterer kann mit Proteinen der extrazellulären Matrix (wie Kollagen und Laminin) beschichtet sein. Die in der Zellkultur verwendeten Medien bestehen aus einem Basismedium, das mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren und Zytokinen angereichert wurde. Ein Zellinkubator ist eine spezielle Art von Laborinkubator, der dazu dient, Zellen bei einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten Gasgemisch (typischerweise 37 °C, 5 % CO₂ für Säugetierzellen) zu kultivieren und zu erhalten. Je nach Art der zu kultivierenden Zellen können die optimalen Bedingungen sehr unterschiedlich sein. Abhängig von den zu züchtenden Zelltypen weist das optimale Wachstumsmedium eine einzigartige Kombination von Faktoren auf, darunter unter anderem pH-Wert, Glukosekonzentration, Wachstumsfaktoren und das Vorhandensein weiterer Nährstoffe.

Antibiotika im Wachstumsmedium sind während der Etablierung der Primärkultur entscheidend, um eine Kontamination durch das Wirtsgewebe zu verhindern. Einige Antibiotikakombinationen bestehen aus Gentamicin, Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B. Von einer langfristigen Anwendung von Antibiotika wird jedoch abgeraten, da einige Wirkstoffe (wie beispielsweise Amphotericin B) auf lange Sicht für die Zellen toxisch sein können.

Die meisten Primärzellen durchlaufen einen Seneszenzprozess und stellen nach einer bestimmten Anzahl von Populationsverdopplungen die Zellteilung ein, weshalb es entscheidend ist, sie nach der Isolierung am Leben zu erhalten. Die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen erfordert fachkundige Zellkulturtechniken und ideale Kulturbedingungen (einschließlich des richtigen Mediums, der richtigen Temperatur, des richtigen Gasgemischs, des richtigen pH-Werts, der richtigen Konzentration an Wachstumsfaktoren, des Vorhandenseins von Nährstoffen und des Vorhandenseins von Glukose). Da viele der zur Anreicherung von Medien verwendeten Wachstumsfaktoren aus tierischem Blut gewonnen werden (die aus Blut stammenden Bestandteile bergen ein Kontaminationsrisiko), wird empfohlen, deren Verwendung zu minimieren oder gänzlich zu vermeiden. Ebenso wichtig ist die Anwendung aseptischer Verfahren.

Subkultur und Erhaltung

Wenn isolierte Zellen an der Oberfläche der Kulturplatte anhaften, markiert dies den Beginn der Erhaltungsphase. Die Anhaftung erfolgt typischerweise 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung. Zellen sollten subkultiviert werden, sobald sie einen bestimmten Konfluenzprozentsatz erreicht haben und sich aktiv vermehren. Da postkonfluente Zellen nach der Passagierung eine Differenzierung durchlaufen und eine langsamere Proliferation aufweisen können, ist es am besten, Primärzellkulturen zu subkultivieren, bevor sie eine 100-prozentige Konfluenz erreichen.

Die Subkultivierung in frischem Medium erhält das exponentielle Wachstum von adhärenten Zellen aufrecht. Die Subkultivierung von Monolayern unterbricht die inter- und intrazellulären Interaktionen an der Zelloberfläche. Zur Ablösung adhärenter Primärzellen aus Monoschichten oder Geweben werden niedrige Konzentrationen proteolytischer Enzyme, wie beispielsweise Trypsin/EDTA, verwendet. Nach der Dissoziation und Verdünnung zu einer Einzelzelllösung werden die Zellen gezählt und in frische Kulturgefäße überführt, um sich dort erneut anzulagern und zu vermehren.

Kryokonservierung und Rückgewinnung

Durch Kryokonservierung werden lebende Zellen durch Einfrieren bei niedrigen Temperaturen erhalten. Die Kryokonservierung und das Auftauen menschlicher Primärzellen verhindern den Zelltod und Zellschäden während der Lagerung und Verwendung. Menschliche Primärzellen werden mit DMSO oder Glycerin kryokonserviert (bei der richtigen Temperatur und mit einer kontrollierten Gefriergeschwindigkeit). Der Gefrierprozess muss schrittweise erfolgen, mit einer Abkühlung von -1 °C pro Minute, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern. Die Langzeitlagerung erfordert flüssigen Stickstoff (-196 °C) oder Temperaturen unter -130 °C.

Zum Auftauen kryokonservierter Zellen reicht es aus, die gefrorenen Zellen etwa 1 bis 2 Minuten lang in ein 37 °C warmes Wasserbad zu tauchen. Menschliche Primärzellen sollten nach dem Auftauen aus dem Gefrierschrank nicht zentrifugiert werden (da sie während der Rückgewinnung aus der Kryokonservierung extrem empfindlich gegenüber Beschädigungen sind). Es eignet sich zum Ausplattieren der Zellen unmittelbar nach dem Auftauen und fördert die Anhaftung in den Kulturen während der ersten 24 Stunden nach dem Ausplattieren. 1 Nachdem sich die kryokonservierten Primärzellen angehaftet haben, muss das verbrauchte Medium entfernt werden (da DMSO für Primärzellen schädlich ist und zu einem Rückgang der Lebensfähigkeit nach dem Auftauen führen kann).