Методи дисоціації клітинних культур

Дисоціація клітинної культури є важливим етапом у догляді за культурою. Він передбачає відокремлення клітин від їхньої ростової поверхні для забезпечення можливості субкультивування або збирання. У цьому розділі описано два основні методи: використання безферментних дисоціаційних буферів і використання ферментних реагентів.

1.використання безферментних буферів для дисоціації клітин

Цей метод є щадним і підтримує клітинну цілісність без використання ферментів:

1. Підготовка
   • Переконайтеся, що всі реагенти підігріті до 37°C перед використанням, щоб уникнути шоку для клітин.
2. Видалення живильного середовища
   • Викиньте старе поживне середовище з культуральної посудини.
3. Промивання
   • Промийте клітинні моношари 5 мл безкальцієвого і безмагнієвого PBS на колбу Т75 або 100-міліметрову чашку.
   • Обережно потрясіть посудину від 30 до 60 секунд при кімнатній температурі.
   • Відфільтруйте та викиньте промивний розчин.
   • Повторіть цей етап промивання ще раз.
4. Дисоціація
   • Додайте приблизно 5 мл безферментного буферу для дисоціації клітин у посудину.
   • Обережно потрясіть при кімнатній температурі протягом 1-2 хвилин і перевірте дисоціацію під мікроскопом.
   • Постукайте колбою або посудиною по руці, щоб зрушити клітини, якщо це необхідно.
   • Якщо клітини прилипли, залиште їх при кімнатній температурі ще на 2-5 хвилин і, за необхідності, постукайте ще раз, використовуючи більше буферу для дисоціації.
   • Коли клітини відокремляться, додайте принаймні 5 мл повного живильного середовища, щоб нейтралізувати дисоціаційний буфер, і знову суспендуйте клітини.
5. Перевірка життєздатності
   • Слідкуйте за життєздатністю клітин під час субкультивування, переконавшись, що вона залишається вище 90%.

2.використання інших реагентів для дисоціації

Цей метод дозволяє використовувати різні реагенти для дисоціації:

1. Видалення використаного середовища
   • Видаліть старе середовище з культуральної посудини.
2. Промивання клітин
   • Промийте клітини збалансованим сольовим розчином, що не містить кальцію і магнію, або використовуйте ЕДТА.
   • Обережно додайте промивний розчин у бік, протилежний клітинам, і потрясіть посудину протягом 1-2 хвилин, перш ніж викинути промивний розчин.
3. Дисоціація
   • Нанесіть 2-3 мл обраного розчину для дисоціації на 25 см² поверхні росту, забезпечуючи покриття клітинного листа.
   • Інкубуйте посудину при 37°C і обережно струшуйте. Дисоціація зазвичай відбувається протягом 5-15 хвилин, залежно від клітинної лінії.
   • Для впертих клітин процес можна прискорити, постукуючи по посудині.
   • Уважно спостерігайте за клітинами, щоб запобігти їх переохолодженню та потенційному пошкодженню.
4. Збір клітин
   • Після того, як клітини будуть повністю відокремлені, дайте їм зібратися на дні посудини, поставивши її вертикально.
   • Додайте повне живильне середовище, потім диспергуйте і зберіть клітини, піпетуючи поверх шару клітин.
   • Порахуйте і продовжуйте субкультивування.

В обох методах важливо визначити оптимальні умови для кожної клітинної лінії шляхом емпіричного спостереження. Процес повинен зберігати життєздатність клітин, яка повинна регулярно перевірятися і перевищувати 90% під час субкультивування. Ці процедури є основою для адаптації дослідників до конкретних вимог і характеристик їхніх клітинних ліній.

3.огляд методів субкультивування адгезивних клітин

Ефективне субкультивування адгезивних клітин вимагає їх відокремлення від культуральної посудини. Для цього застосовують різні методи, кожен з яких підходить для різних типів клітин і умов. При виборі методу дисоціації важливо враховувати специфічні потреби клітинної лінії та цілі експерименту. Регулярний моніторинг життєздатності клітин, з метою досягнення більш ніж 90% на момент субкультивування, є важливим для збереження здоров'я і продуктивності культури. Нижче наведено огляд цих процедур: