Опубліковано: 2023 | Останній перегляд: травень 2026

Методи дисоціації клітинних культур

Дисоціація клітинної культури є критично важливим етапом у підтримці клітинної культури. Вона передбачає відокремлення клітин від поверхні, на якій вони ростуть, для подальшого субкультивування або збору. У цьому розділі описано два основні методи: використання безферментних буферів для дисоціації та використання ферментних реагентів.

Використання безферментних буферів для дисоціації клітин

Цей метод є щадним і дозволяє зберегти цілісність клітин без використання ферментів:

1. Підготовка
   • Перед використанням переконайтеся, що всі реагенти нагріті до 37 °C, щоб уникнути шоку для клітин.
2. Видалення середовища для росту:
   • Вилийте старе середовище для росту з культуральної посудини.
3. Промивання
   • Промийте моношари клітин 5 мл PBS без кальцію та магнію на кожну колбу T75 або чашку діаметром 100 мм.
   • Акуратно струшуйте посудину протягом 30–60 секунд при кімнатній температурі.
   • Відсмокчіть і видаліть розчин для промивання.
   • Повторіть цей етап промивання ще раз.
4. Роз'єднання
   • Додайте до посудини приблизно 5 мл буферу для дисоціації клітин без ферментів.
   • Акуратно похитуйте при кімнатній температурі протягом 1–2 хвилин і перевірте дисоціацію під мікроскопом.
   • При необхідності постукайте колбою або чашкою об долоню, щоб відокремити клітини.
   • Якщо клітини прилипли, залиште їх при кімнатній температурі ще на 2–5 хвилин і, за потреби, знову постукайте, використовуючи більше буфера для дисоціації.
   • Після відриву клітин додайте щонайменше 5 мл повного середовища для культивування, щоб нейтралізувати буфер для дисоціації та ресуспендувати клітини.
5. Перевірка життєздатності
   • Контролюйте життєздатність клітин під час субкультурування, переконуючись, що вона залишається вище 90%.

Використання інших реагентів для дисоціації

Цей метод дозволяє використовувати різні реагенти для дисоціації:

1. Видалення використаного середовища
   • Вилийте старе середовище з культурального посуду.
2. Промивання клітин
   • Промийте клітини збалансованим сольовим розчином, що не містить кальцію та магнію, або використовуйте ЕДТА.
   • Акуратно додайте промивний розчин з боку, протилежного клітинам, і похитуйте посудину протягом 1–2 хвилин, перш ніж видалити промивну рідину.
3. Дисоціація
   • Нанесіть 2–3 мл обраного розчину для дисоціації на 25 см² поверхні для росту, забезпечивши покриття клітинного шару.
   • Інкубуйте посудину при 37 °C, обережно похитуючи. Дисоціація зазвичай відбувається протягом 5–15 хвилин, залежно від клітинної лінії.
   • Для клітин, що важко відокремлюються, процес можна прискорити, легенько постукуючи по посудині.
   • Уважно спостерігайте за клітинами, щоб запобігти надмірному впливу та потенційному пошкодженню.
4. Збирання клітин
   • Після повного відриву клітин дайте їм зібратися на дні посудини, поставивши її вертикально.
   • Додайте повне середовище, потім диспергуйте та зіберіть клітини, піпетуючи над шаром клітин.
   • Підрахуйте клітини та приступайте до субкультури.

В обох методах важливо визначити оптимальні умови для кожної клітинної лінії шляхом емпіричного спостереження. Процес повинен зберігати життєздатність клітин, яка під час субкультури повинна регулярно перевірятися і перевищувати 90%. Ці процедури надають дослідникам основу для адаптації відповідно до конкретних вимог та характеристик їхніх клітинних ліній.

Огляд методів субкультури адгезивних клітин

Ефективне субкультивування адгезивних клітин вимагає їх відриву від культурального посуду. Застосовуються різні методи, кожен з яких підходить для різних типів клітин та умов. При виборі методу дисоціації важливо враховувати конкретні потреби клітинної лінії та цілі експерименту. Регулярний моніторинг життєздатності клітин, з метою досягнення рівня понад 90% на момент субкультури, є необхідним для збереження здоров'я та продуктивності культури. Ось огляд цих процедур: