Опубліковано: 2023 | Останнє оновлення: травень 2026

Повний посібник із заморожування клітин: забезпечення життєздатності та стерильності

Заморожування клітин є критично важливим процесом в управлінні клітинними культурами, що забезпечує довгострокове зберігання та збереження цінних клітинних ліній. Незалежно від того, чи працюєте ви з клітинами людини чи тварин, дотримання точних протоколів та суворих асептичних технік є надзвичайно важливим для успішної кріоконсервації.

Цей посібник містить докладні інструкції щодо необхідних матеріалів, реагентів та покрокових процедур для ефективного заморожування клітин із збереженням їх життєздатності та стерильності. Дотримуючись цих рекомендацій, дослідники можуть впевнено зберігати та згодом відновлювати клітинні культури з мінімальною втратою життєздатності клітин, зберігаючи цілісність та надійність результатів своїх експериментів.

Для початку необхідно створити стерильне робоче середовище. Належні асептичні методи відіграють вирішальну роль у запобіганні забрудненню та забезпеченні стерильності культур.

Асептична техніка

Дотримуйтесь асептичних методів протягом усього процесу, щоб забезпечити стерильність культур.

Комплексний процес заморожування клітин

Ця схема містить детальний візуальний посібник з основних етапів правильного заморожування клітин. Дотримуйтесь цих процедур, щоб забезпечити високу життєздатність та цілісність клітин під час процесу кріоконсервації.

Підготовка середовища для заморожування

Підготуйте кріопротекторне середовище для заморожування відповідно до типу клітин:

Культури в середовищах, що містять FBS: 90% FBS + 10% DMSO або 70% середовища для росту, 20% FBS і 10% DMSO
Клітини, що потребують гліцерину: 90% FBS + 10% гліцерину

Розгляньте можливість придбання нашого готового заморожувального середовища:

Заморожувальний розчин CM-1: для протоколів, що вимагають середовища, яке містить фетальну бичачу сироватку (FBS)
Середовище для заморожування CM-ACF — без сироватки: для альтернативи без FBS

Маркування та документація

Маркуйте кріопробірки, вказавши наступні дані:

Дата
Ім'я дослідника
Номер клітин
Номер пасажу
Тип клітин
Будь-яка додаткова інформація (наприклад, генетичні модифікації)

Підготовка клітин

Для адгезивних клітин:

Спостерігайте за клітинами, поки вони не досягнуть 85–95% конфуентності
Видалити старе культуральне середовище
Промийте моношар клітин PBS без кальцію та магнію
Відокремте клітини за допомогою Accutase, трипсину або трипсину-EDTA та, за необхідності, нейтралізуйте культуральним середовищем
Перенесіть суспензію клітин у пробірку Falcon об'ємом 50 мл

Для клітин у суспензії:

Перевірте щільність та стан клітин під мікроскопом
Перенесіть суспензію клітин безпосередньо в пробірку Falcon об'ємом 50 мл

Підрахунок клітин та центрифугування

Підрахуйте клітини за допомогою гемоцитометра або автоматичного лічильника клітин
Центрифугуйте при 300g протягом 3-5 хвилин при кімнатній температурі для осадження клітин
Обережно відсмокчіть супернатант, не порушуючи осаду клітин
Перед використанням нагрійте підготовлене заморожувальне середовище до 37 °C

Кріоконсервація

Ресуспендуйте осад клітин у заморожувальному середовищі до щільності 2,0 млн клітин/мл для адгезивних клітин та 5 млн клітин/мл для клітин у суспензії, або до бажаної концентрації
Розлийте 1,0 мл (або більше, за необхідності) суспензії клітин у марковані кріопробірки
Перед перенесенням клітин на довгострокове зберігання використовуйте метод повільного заморожування

? Метод: ? Етапи
❄️ Ручне заморожування: 1️⃣ Помістіть клітини в заморожувальний розчин у морозильну камеру при температурі 4 °C на 40 хвилин.
2️⃣ Перенесіть у морозильну камеру при температурі -80 °C на 24 години.
3️⃣ Зберігайте клітини в рідкому азоті для довгострокового зберігання.
? Використання Mr. Frosty: 1️⃣ Підготуйте клітини в кріопробірках із заморожувальним середовищем.
2️⃣ Помістіть кріопробірки в контейнер Mr. Frosty.
3️⃣ Зберігайте при температурі -80 °C протягом 24 годин, перш ніж перенести в рідкий азот.
? Морозильна камера з контрольованою швидкістю: 1️⃣ Налаштуйте пристрій на поступове зниження температури.
2️⃣ Помістіть підготовлені клітини в морозильну камеру.
3️⃣ Після завершення циклу заморожування перенесіть клітини в рідкий азот.

Зберігайте кріопробірки при температурі нижче -130 °C або в рідкому азоті для довгострокового зберігання.

Матеріали та реагенти

Кріопробірки об'ємом 1–2 мл
Морозильна камера CoolCell® або морозильна камера з контрольованою швидкістю
Кріозахисне середовище для заморожування (наприклад, саморобне кріозахисне середовище, CM-1, CM-ACF або спеціалізовані середовища)
Фетальна бичача сироватка (FBS) або кондиціоновані середовища
ДМСО або гліцерин
PBS без кальцію та магнію
Accutase, трипсин або трипсин-EDTA (для адгезивних клітин)
Пробірки Falcon об'ємом 15 мл або 50 мл
Гемоцитометр або автоматичний лічильник клітин
Центрифуга