Вичерпний посібник із заморожування клітин: Забезпечення життєздатності та стерильності

Заморожування клітин є критично важливим процесом в управлінні культурою клітин, що забезпечує довготривале зберігання і збереження цінних клітинних ліній. Незалежно від того, чи працюєте ви з клітинами людини або тварин, дотримання точних протоколів і суворої асептики є першочерговим для досягнення успішної кріоконсервації.

Цей посібник містить детальні інструкції щодо необхідних матеріалів, реагентів та покрокових процедур для ефективного заморожування клітин зі збереженням їх життєздатності та стерильності. Дотримуючись цих рекомендацій, дослідники можуть впевнено зберігати і згодом оживляти культури клітин з мінімальною втратою їх життєздатності, зберігаючи цілісність і надійність результатів своїх експериментів.

Для початку необхідно створити стерильне робоче середовище. Належна асептична техніка відіграє вирішальну роль у запобіганні контамінації та забезпеченні стерильності культур.

Асептична техніка

Дотримуйтесь асептичних методів протягом усього процесу, щоб забезпечити стерильність культур.

Комплексний процес заморожування комірок

Ця блок-схема містить детальний візуальний посібник з основних кроків, необхідних для правильного заморожування клітин. Дотримуйтесь цих процедур, щоб забезпечити високу життєздатність і цілісність клітин під час процесу кріоконсервування.

Підготовка середовища для заморожування

Підготуйте кріозахисне середовище для заморожування відповідно до типу клітин:

Культури, що містять FBS: 90% FBS + 10% DMSO або 70% живильне середовище, 20% FBS і 10% DMSO
Клітини, що потребують гліцерину: 90% FBS + 10% гліцерину

Розгляньте можливість придбання наших попередньо сформованих середовищ для заморожування:

Середовище для заморожуванняCM-1: для протоколів, що вимагають середовища, яке містить фетальну сироватку великої рогатої худоби (FBS)
Середовище для заморожування CM-ACF - без сироватки: Для альтернативи без FBS

Маркування та документація

Маркуйте кріоконтейнери з наступною інформацією:

Дата
Ім'я дослідника
Номер комірки
Номер пасажу
Тип клітини
Будь-яка додаткова інформація (наприклад, генетичні модифікації)

Підготовка клітин

Для адгезійних клітин:

Спостерігайте за клітинами, поки вони не досягнуть 85-95% злиття
Аспіруйте старе культуральне середовище
Промийте клітинний моношар безкальцієвим та безмагнієвим PBS
Відокремте клітини за допомогою аккутази, трипсину або трипсин-ЕДТА та нейтралізуйте культуральним середовищем, якщо потрібно
Перенесіть клітинну суспензію в пробірку Falcon на 50 мл

Для суспензійних клітин:

Перевірте щільність і стан клітин під мікроскопом
Перенесіть клітинну суспензію безпосередньо в пробірку Falcon на 50 мл

Підрахунок клітин та центрифугування

Підрахуйте клітини за допомогою гемоцитометра або автоматичного лічильника клітин
Центрифугуйте при 300g протягом 3-5 хвилин при кімнатній температурі для осадження клітин
Аспіруйте надосадову рідину обережно, уникаючи порушення гранул клітин
Перед використанням підігрійте підготовлене заморожувальне середовище до 37°C

Кріоконсервування

Ресуспендуйте гранули клітин у середовищі для заморожування до щільності 2,0 млн клітин/мл для адгезивних клітин та 5 млн клітин/мл для суспензійних клітин або до бажаної концентрації
Розподіліть 1,0 мл (або більше, якщо потрібно) клітинної суспензії в промарковані кріопробірки
Використовуйте метод повільного заморожування перед перенесенням клітин на довгострокове зберігання

? Метод	? Етапи
❄️ Заморожування вручну	1️⃣ Помістіть клітини в середовище для заморожування в морозильну камеру при 4°C на 40 хвилин. 2️⃣ Перенесіть в морозильну камеру при -80°C на 24 години. 3️⃣ Зберігайте клітини в рідкому азоті для довготривалого збереження
? За допомогою містера Фрості	1️⃣ Підготуйте клітини в кріопробірках із заморожувальним середовищем. 2️⃣ Помістіть кріовіали в контейнер містера Фрості. 3️⃣ Зберігайте при -80°C протягом 24 годин перед перенесенням у рідкий азот
? Заморожування з контрольованою швидкістю	1️⃣ Запрограмуйте пристрій на поступове зниження температури. 2️⃣ Помістіть підготовлені клітини в морозильну камеру. 3️⃣ Після циклу заморожування перенесіть клітини в рідкий азот

Зберігайте кріопробірки при температурі нижче -130°C або в рідкому азоті для довготривалого збереження.

Матеріали та реагенти

1-2 мл кріопробірки
Заморожувач CoolCell® або контрольоване заморожування
Кріозахисне заморожувальне середовище (наприклад, саморобні кріозахисні середовища, CM-1, CM-ACF або спеціалізовані середовища)
Фетальна сироватка великої рогатої худоби (FBS) або кондиціоновані середовища
ДМСО або гліцерин
PBS без кальцію та магнію
Аккутаза, трипсин або трипсин-ЕДТА (для адгезивних клітин)
пробірки Фалькона на 15 мл або 50 мл
Гемоцитометр або автоматичний лічильник клітин
Центрифуга