Клітини HuH7: основа досліджень гепатоми та вірусу гепатиту С

Клітинна лінія HuH7, отримана з гепатоми людини, являє собою безсмертну колекцію пухлиногенних епітеліоподібних клітин. Ця лінія, разом із її похідними HuH7.5 та HuH7.5.1, слугує практичним замінником первинних гепатоцитів в експериментальних умовах. Вона переважно використовується в моделях клітинних культур для дослідження інфекції вірусом гепатиту С (ВГС) та патофізіології гепатоми.

Походження та характеристики клітин HuH7

Перед застосуванням клітинної лінії HuH7 у дослідженнях необхідно зрозуміти її походження, основні особливості та оптимальні умови культивування.

Клітинна лінія HuH7 була створена Сато, Дж. та Накабаїші, Х. у 1982 році на основі високодиференційованого лінійного раку гепатоцитів. Спочатку вона була отримана з гепатоцелюлярної карциноми у 57-річного японського чоловіка. Характеризуючись здатністю продукувати різні фізіологічно значущі речовини, такі як альбумін та альфа-фетопротеїн, клітини HuH7 виявляють високу сприйнятливість до інфікування вірусом гепатиту С (HCV), що робить їх придатними для використання в системах репліконів HCV. Ця особливість робить клітинну лінію цінною для скринінгу та розробки противірусних препаратів проти HCV. Клітини HuH7 мають епітеліоподібну морфологію з шестикутною формою та прилипають до поверхонь, утворюючи під час росту двовимірні моношари. У середньому клітини HuH7 мають діаметр 21,9 мкм і, як правило, мають більший розмір та сплощений вигляд. Клітинна лінія HuH7 характеризується гетерогенною кількістю хромосом, яка зазвичай коливається від 55 до 63, що відображає генетичну мінливість у клітинній популяції. Ця гетерогенність є наслідком селективного тиску, що виникає під час культивування клітин, і може варіюватися залежно від умов у різних лабораторіях.

Порівняльний аналіз: клітинні лінії HuH7 та HuH7.5

Клітинна лінія HuH7.5, похідна від HuH7, відрізняється насамперед місенс-мутацією в гені RIG-I (DDX58), що має вирішальне значення для внутрішньоклітинної противірусної відповіді. Ця мутація підвищує сприйнятливість клітин HuH7.5 до реплікації геномної та субгеномної РНК вірусу гепатиту С (HCV), що відрізняє її від вихідної клітинної лінії HuH7 з точки зору її корисності у вірусологічних дослідженнях.

Культивування клітин HuH7: основні протоколи для забезпечення оптимального росту

Клітини HuH7, які є невід'ємною частиною безлічі наукових досліджень, потребують точних умов культивування для успішного росту. У цьому розділі розглядаються основні аспекти культивування клітин HuH7, що забезпечують збереження їх фізіологічної значущості в наукових дослідженнях.

Динаміка часу подвоєння

Час подвоєння клітин HuH7 зазвичай становить 24 години, хоча варіації в середовищах для культивування клітин можуть подовжити цей період до 36–48 годин, що підкреслює вплив умов середовища на клітинну проліферацію.

Характеристики адгезії

Клітини HuH7 переважно утворюють двовимірний моношар, прилипаючи до поверхонь культуральних чашок та колб, що підкреслює їхню перевагу стабільному фізичному субстрату над суспензійними культурами.

Оптимальна щільність висівання

Підтримка конfluентності клітин HuH7 в діапазоні 30–90 % є критично важливою для запобігання зниженню темпів проліферації при конfluентності понад 90 %. Субкультурування з використанням Accutase полегшує відшарування, що дозволяє проводити висівання з щільністю, адаптованою до експериментальних потреб, в діапазоні від оптимального (2×10⁴ клітин/см²) до насиченого (6×10⁴ клітин/см²) рівнів.

Поживні вимоги

Модифіковане середовище Дульбекко (DMEM) з високим вмістом глюкози та з додаванням 10% ембріональної сироватки бика (FBS) забезпечує ідеальне поживне середовище для клітин HuH7. Регулярне оновлення середовища, бажано 2–3 рази на тиждень, є критично важливим для підтримання здоров’я клітин.

Умови середовища

Зволожений інкубатор, налаштований на 5% CO₂ та 37°C, оптимально підтримує культуру клітин HuH7, імітуючи фізіологічні умови, сприятливі для клітинної активності.

Довгострокове зберігання

Для тривалого зберігання клітини HuH7 слід зберігати у паровій фазі рідкого азоту, що забезпечить їх життєздатність для майбутніх досліджень.

Кріоконсервація та відновлення

Застосування техніки поступового заморожування має вирішальне значення для збереження життєздатності клітин під час кріоконсервації. Клітини слід суспендувати у спеціально розробленому заморожувальному середовищі, такому як CM-1, що забезпечує плавний перехід до кріогенного зберігання. Після розморожування для відновлення клітинних культур необхідне швидке, але обережне відновлення у водяній бані при температурі 37 °C, а потім центрифугування для видалення заморожувального середовища та повторне суспендування у свіжому середовищі для росту.

Питання біобезпеки

Для роботи з клітинною лінією HuH7 та її розмноження рекомендується дотримуватися протоколу біобезпеки рівня 1, що відповідає стандартам безпеки та етики в лабораторних умовах.

Дотримуючись цих ретельно розроблених умов культивування, дослідники можуть забезпечити стабільний ріст та фізіологічну релевантність клітин HuH7 у своїх наукових дослідженнях, прокладаючи шлях до революційних відкриттів у дослідженні гепатоми та вірусу гепатиту С.

Використовуйте клітини HuH7 для своїх наукових відкриттів

Клітини HuH7: переваги та недоліки

Клітинна лінія HuH7 має як переваги, так і обмеження. Давайте розглянемо потенційні плюси та мінуси цієї клітинної лінії, оскільки це може допомогти вам вирішити, чи підходить вона для ваших експериментів.

Переваги клітинної лінії HuH7

Клітини HuH7 мають багато характерних особливостей, що робить їх привабливими для використання в дослідженнях.

• Легке розмноження: на відміну від інших ліній клітин гепатоми людини, клітинну лінію HuH7 можна легко культивувати без додавання сироватки; проте CLS рекомендує використовувати RPMI 1640 з 10% FBS та 2 мМ L-глутаміну. Клітини HuH-7 секретують фактор росту, який допомагає клітинам рости без сироватки.
• Гнучкість трансфекції: Клітинна лінія HuH7 широко використовується для трансфекції завдяки своїй високій сприйнятливості до геному вірусу гепатиту С (HCV). Тому ці клітини відіграють ключову роль у скринінгу та розробці препаратів проти HCV.
• Альтернатива гепатоцитам людини: Клітинна лінія HuH7 є чудовою заміною гепатоцитам людини. Вона може допомогти дослідникам вивчати печінкові транспортери ліків та зрозуміти взаємодію певних ліків з MRP (білками, пов’язаними з мультирезистентністю).
• Розробка мишачої моделі ксенотрансплантата: Клітини HuH7 використовувалися для створення мишачої моделі ксенотрансплантата, що походить від клітинної лінії. Ця тваринна модель може надати дослідникам цінну інформацію про інгібітори протеїнкінази та протиракові терапії.
• Дослідження раку: Клітинна лінія HuH7 — це лінія клітин раку печінки людини, яка допомагає дослідникам проводити дослідження раку печінки.

Обмеження клітинної лінії HuH-7

Існують деякі обмеження, пов'язані з культивуванням клітинної лінії HuH7.

Мікробне забруднення: Бактеріальне забруднення є найпоширенішою проблемою в клітинній культурі. Коли відбувається інфекція, її можна розпізнати за зміною рН та каламутністю культурального середовища. Серед бактеріальних забруднень забруднення мікоплазмою зазвичай не є очевидним. Однак воно повільно впливає на морфологію, експресію генів та інші характеристики клітинної лінії.

Період культивування: Хоча клітинна лінія HuH7 є безсмертною, перевищення періоду культивування може поступово впливати на здоров'я клітин. Це може вплинути на швидкість проліферації та експресію генів, що може знизити відтворюваність результатів. Для клітинної лінії HuH7 кількість пасажів слід підтримувати на рівні нижче 20–25.

Застосування клітин HuH-7

Ця клітинна лінія, отримана з гепатоми людини, має багато застосувань у наукових дослідженнях. Тут ми описуємо кілька напрямків досліджень, у яких використовується клітинна лінія HuH7.

1. Резистентність до ліків: HuH7 — це клітинна лінія гепатоцелюлярної карциноми (ГЦК), яку можна використовувати для вивчення резистентності до потенційних методів лікування раку печінки. У дослідженні, проведеному в 2021 році, використовували клітини HuH7, які експериментально зробили резистентними до сорафенібу, для розробки нових та ефективних терапевтичних засобів, а саме пептидів самозбірки, що накопичуються в мітохондріях.

2. Генетичні відомості та молекулярне профілювання за допомогою клітин HuH7: Різні клітинні лінії HuH7, включаючи різні похідні та варіанти, дозволили глибше зрозуміти експресію генів та роль конкретних геномних маркерів у захворюванні. Такі методи, як раманівська спектроскопія, яку відстоюють такі дослідники, як Євген Гладилін, застосовувалися до клітин HuH7 для молекулярного та клітинного профілювання, що дало змогу отримати уявлення про клітинну реакцію на вірусну інфекцію. Потенціал раманівської спектроскопії в поєднанні з такими методами, як кількісна протеоміка, сприяв дослідженню реакцій клітин-господарів, включаючи інтерферонову реакцію та зміни в ліпідних краплях, що є критично важливими для розуміння реплікації вірусу гепатиту С (HCV) та впливу SARS. Експресію різних онкогенних маркерів можна досліджувати, щоб зрозуміти їхню поведінку у відповідь на будь-яке лікування, як, наприклад, у дослідженні, в якому використовували клітини HuH7 для вивчення впливу сполуки кемпферолу на патерн експресії генів MMP9 та шляху AKT. Ці шляхи регулюють метастазування та інвазивність гепатоцелюлярної карциноми. В іншому недавньому дослідженні також вивчалася роль гена сигнального каскаду Wnt/β-катеніну у виживанні та рості клітин ГЦК.

3. Розробка ліків: Клітини HuH7 широко використовуються в скринінгу та розробці ліків проти раку печінки. Було проведено численні дослідження для вивчення інгібуючого потенціалу багатьох рослинних екстрактів, сполук на рослинній основі, наночастинок та інших терапевтичних засобів проти ГЦК. У дослідженні, проведеному в 2022 році, вивчалися проапоптотичні та протиракові властивості радіонукліду проти гепатоцелюлярної карциноми з використанням клітинної лінії HuH7.

4. Клітини HuH7: центральний елемент вірусних досліджень та клітинного аналізу Клітини HuH7 стали наріжним каменем у вивченні вірусних інфекцій та інфекційних захворювань, зокрема вірусу гепатиту С (ВГС) та їх взаємодії з коронавірусами, такими як SARS-CoV-2, що викликає коронавірусну хворобу 2019 (COVID-19). Розробка експериментальних систем клітинних культур HCV (HCVcc) з використанням клітин HuH7 значно покращила наші можливості вивчати складний процес реплікації HCV та фактори хазяїна, необхідні для інфікування HCV. Це включає вивчення ефективності реплікації РНК HCV та утворення інфекційних віріонів. Різні лінії клітин HuH7, включаючи старіючі та інфіковані варіанти, забезпечують різноманітний набір для дослідження множинності інфекції, поширення вірусу та механізмів інгібування проти вірусів, таких як SARS.

Підсумовуючи, дослідження клітин HuH7 охоплює широкий спектр наукових питань, від молекулярних механізмів, що лежать в основі вірусних інфекцій, до детальних клітинних реакцій, викликаних цими патогенами. Через призму досліджень HuH7 наукова спільнота продовжує розкривати складну динаміку взаємодій між хазяїном і вірусом, сприяючи розвитку антивірусних стратегій та нашому розумінню клітинних детермінант вірусних захворювань.

Публікації про HuH-7

Існує безліч публікацій, в яких клітинна лінія HuH7 використовується для різних цілей. Тут ми згадали кілька останніх і значущих публікацій.

• Застосування самоорганізованих пептидів, що націлені на мітохондрії, як нового методу лікування клітин гепатоцелюлярної карциноми, резистентних до сорафенібу.

Це дослідження було опубліковано в журналі Nature Scientific Reports у 2021 році. У дослідженні використовували експериментально індуковані клітини гепатоцелюлярної карциноми, резистентні до сорафенібу (клітинна лінія HuH7), для вивчення проапоптотичних та протипухлинних ефектів нещодавно розроблених Mito-FF (самоорганізованих пептидів, що накопичуються в мітохондріях).

• Кемпферол інгібує міграцію клітин гепатоцелюлярної карциноми людини шляхом пригнічення MMP-9 та сигнального шляху Akt

Ця стаття була опублікована в журналі «Environmental Toxicology» По-Чун Джу та колегами у 2021 році. У цьому дослідженні вчені вивчали антиметастатичний потенціал рослинного сполуки кемпферолу проти клітин гепатоцелюлярної карциноми (HuH7). Крім того, вони також досліджували сигнальні шляхи, що регулюють метастазування та інвазію клітин раку печінки.

• Дафнетин пригнічує виживання клітин гепатоцелюлярної карциноми шляхом регулювання сигнального шляху Wnt/β-катенін

Ця стаття була опублікована в журналі Drug Development Research у 2022 році. Це дослідження пояснює протиракову роль сполуки дафнетину проти ГЦК. Ця сполука рослинного походження пригнічує сигнальний шлях Wnt/β-катеніну, щоб обмежити ріст ракових клітин.

• RGFP966 пригнічує ріст та міграцію пухлини шляхом інгібування експресії EGFR у клітинах гепатоцелюлярної карциноми in vitro

Ця наукова стаття, опублікована в журналі «Drug Design, Development, and Therapy», описує роль сигнального шляху EGFR у рості та метастазуванні гепатоцелюлярної карциноми. У дослідженні використовували клітини HuH7 для вивчення інгібуючого ефекту RGFP966, інгібітора гістондеацетилази 3 (HDAC3), проти ГЦК шляхом пригнічення генів шляху EGFR.

• Перренат ренію (188ReO4) індукував апоптоз та зменшив раковий фенотип у клітинах раку печінки

Ця публікація в журналі Cells вказує на використання клітин HuH7 для дослідження анти-ГЦК потенціалу радіонукліду, а саме перхеніату ренію.

• Противірусна активність наночастинок хітозану, що інкапсулюють куркумін, проти вірусу гепатиту С генотипу 4a в клітинних лініях гепатоми людини

Це дослідження опубліковано в журналі International Journal of Nanomedicine. У дослідженні використовували клітини HuH7 для вивчення противірусної активності наночастинок хітозану, що містять куркумін, проти вірусу гепатиту С генотипу 4a.

Ресурси HuH-7: протоколи, відео та інше

Існує багато ресурсів, присвячених культивуванню та підтримці клітинної лінії HuH7. Тут ви дізнаєтеся про ресурси, що пояснюють протоколи культивування клітин та трансфекції для HuH7, а також про навчальні відео.

Протоколи культивування клітин

Наступні ресурси допоможуть вам розпочати культивування та утримання клітин HuH7.

• Інформація та ресурси щодо культивування клітин HuH-7: Цей веб-сайт містить багато корисної інформації, зокрема протокол субкультивування клітинної лінії HuH7, її зберігання та поводження з нею.

• Протокол культивування клітин HuH7

Протоколи трансфекції HuH7

Трансфекція клітин HuH7 здійснюється різними способами. Наведені нижче ресурси містять велику кількість інформації щодо протоколів трансфекції, необхідних реагентів та хімічних речовин, корисних порад та заходів безпеки.

Відео, пов'язані з клітинною лінією HuH7

Існує багато навчальних відео про основні протоколи субкультурування, висівання та трансфекції тощо.

• Пасажування клітин: Основи культивування клітин: Це відео присвячене основному протоколу культивування клітинної лінії.

Ми сподіваємося, що інформація, наведена в цій статті, допоможе вам отримати базові та поглиблені знання про клітинну лінію HuH7 перед початком роботи з нею. Якщо ви хочете використовувати ці клітини у своїх наукових дослідженнях, ви можете замовити їх у нас.

Поширені запитання щодо клітинної лінії HuH7 та досліджень вірусів