Клітини HaCaT - дослідження біології та захворювань шкіри

2.генетичні характеристики та походження клітин HaCaT

Клітини HaCaT - це спонтанно імморталізована клітинна лінія кератиноцитів людини, що походить зі шкіри дорослої людини і являє собою унікальний еволюційний шлях. Ці клітини мають мутації в обох алелях гена р53, що є типовим для мутацій, індукованих УФ-випромінюванням [3,4]. Крім того, припускають, що клітини HaCaT виникли внаслідок мутацій гена-супресора пухлин p53 з подальшою втратою генів старіння [5].

Ген-супресор пухлин p53, відомий своєю роллю в репарації ДНК і як охоронець геному, індукує реакцію шкіри людини на пошкодження ДНК [4]. Було помічено, що клітини HaCaT частково втратили механізм захисту від пошкодження ДНК через мутацію гена p53 in vivo, що робить їх чутливими до накопичення цитогенетичних змін у відповідь на підвищену температуру культивування. Іншим механізмом імморталізації клітин HaCaT є підвищена активність ферменту теломерази [7]. У нормальних клітинах теломери безперервно вкорочуються з кожним клітинним поділом, поки не настає клітинне старіння. Теломераза - це спеціалізований клітинний ферментний комплекс зі зворотною транскриптазною активністю, який підтримує стабільну довжину теломер. На противагу цьому, клітини HaCaT демонструють значно підвищену активність теломерази, що призводить до підтримання стабільної довжини теломер. Ці спостереження підтверджують роль теломерази в процесі імморталізації клітин HaCaT.

Було ідентифіковано три специфічні хромосомні транслокації, які призводять до втрати по одній копії плечей хромосом 3p, 4p і 9p, приросту 9q та утворення ізохромосоми. Втрата короткого плеча хромосоми 3p може призвести до втрати генів старіння і безсмертя клітин HaCaT [8]. Клітини HaCaT є гіподиплоїдними і мають чіткі та стабільні маркерні хромосоми, що свідчить про їх моноклональне походження. Характеристики та головна лінія клітин HaCaT були підтверджені за допомогою ДНК-дактилоскопії з використанням гіперваріабельних мінісателітних маркерів [3-6].

3.як зібрати клітини HaCaT за 5 простих кроків

4. Видаліть культуральне середовище і промийте прилиплі клітини, використовуючи 3-5 мл PBS без кальцію і магнію для колб Т25 або 5-10 мл для колб Т75.
5. Додайте 1-2 мл свіжоприготованого 0,05% розчину ЕДТА на колбу Т25 або 2,5 мл на колбу Т75, переконавшись, що весь клітинний лист покритий, та інкубуйте при 37°C протягом 10 хвилин.
6. Додайте 1 мл свіжоприготованого розчину трипсину/ЕДТА (0,05%/0,025%) на колбу Т25 або 2,5 мл на колбу Т75, знову переконавшись, що клітини повністю покриті. Клітини повинні відокремитися протягом 1-2 хвилин.
7. Зупиніть активність трипсину, додавши середовище для культивування клітин, що містить FBS.
8. Розподіліть клітини в нові колби зі свіжим живильним середовищем.

4. Застосування клітин HaCaT

Клітини HaCaT є цінним інструментом для вивчення кератиноцитів [9]. Ці безсмертні клітини функціонують як переднеопластичні клітини і можуть дати уявлення про зміни, пов'язані зі злоякісною та неопластичною трансформацією [10]. Моношарові культури клітин HaCaT необхідні для аналізу клітинної токсичності та загоєння ран in vitro. Клітини HaCaT також можуть бути використані для оцінки токсичності шкіри, спричиненої різними агентами та неопластичними або запальними процесами. Вони можуть бути використані для аналізу різних механізмів шкірних алергічних реакцій, впливу активних форм кисню та опромінення ультрафіолетом. Після стимуляції клітини HaCaT можуть диференціюватися і експресувати специфічні маркери диференціації, такі як інволюкрин, K14 і K10. Клітини HaCaT також широко використовуються як модель для вивчення патофізіології епідермального гомеостазу [6].

Клітини HaCaT зберігають здатність відновлювати структурований епідерміс in vivo після трансплантації, в результаті чого утворюється стратифікована структура епідермісу, яка може бути повернута між базальним і диференційованим станом при зміні концентрації кальцію в середовищі. Ці клітини також дозволяють характеризувати деякі біологічні процеси, наприклад, їх використання в якості модельної системи вітаміну D і метаболізму в шкірі. Оскільки клітини HaCaT не є генно-інженерними, вони дають об'єктивне уявлення про широкий спектр початкових генетичних подій у шкірі людини.

5. Рекомендовані відео: Дослідження світу клітин HaCaT

"Міграція клітин HaCaT": Це відео демонструє процес міграції клітин у клітинах HaCaT. Міграція клітин є важливим процесом для різних біологічних процесів, таких як загоєння ран і метастазування раку. Відео демонструє рух клітин HaCaT під мікроскопом, забезпечуючи візуальне уявлення про те, як ці клітини мігрують. Активність клітин спостерігається, коли вони переміщуються з одного місця в інше, і відео дає чітку ілюстрацію змін, які відбуваються в клітинах під час цього процесу.

"Аналіз подряпин на клітинах HaCaT": Це відео демонструє скретч-тест, проведений на клітинах HaCaT. Скретч-тест є широко використовуваною технікою для вивчення міграції клітин, і в даному випадку він використовується для аналізу міграції клітин HaCaT. Відео демонструє процес створення подряпини на поверхні чашки з культурою клітин, яку потім спостерігають під мікроскопом, як клітини HaCaT мігрують і з часом закривають щілину.

"Клітинний ріст кератиноцитів HaCaT для експериментів з загоєння ран": Це відео демонструє процес росту кератиноцитів HaCaT для експериментів із загоєння ран. Кератиноцити HaCaT є широко використовуваною клітинною лінією в дослідженнях загоєння ран.

"Диференціація клітин HaCaT": Це відео демонструє необхідні кроки для диференціації клітин HaCaT. Клітини HaCaT можуть диференціюватися в різні типи клітин шкіри. Відео демонструє зміни в клітинах HaCaT в процесі їх диференціювання, візуально представляючи різні маркери та характеристики диференціювання. Процес диференціювання є критично важливим для нормального функціонування шкіри, і відео висвітлює різні етапи диференціювання, які проходять клітини HaCaT.

Джерела

1. Ангел П. та Карін М. Роль Jun, Fos та комплексу AP-1 у проліферації та трансформації клітин. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: Регуляція епідермального гіперпластичного росту. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Баден Х.П., Кубілус Я., Кведар Я.С., Штайнберг М.Л., Вольман С.Р.: Виділення та характеристика спонтанно виникаючої довгоживучої лінії кератиноцитів людини (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: мутації p53 в іморталізованих епітеліальних клітинних лініях людини. Канцерогенез 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Гарячі точки мутацій під впливом сонячного світла в гені p53 немеланомного раку шкіри. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Множинні стадії і генетичні зміни в імморталізації, злоякісній трансформації і пухлинній прогресії кератиноцитів шкіри людини. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Активність теломерази в регенеративному базальному шарі епідермісу шкіри людини та в безсмертних і карциноматозних кератиноцитах шкіри. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R та ін. Клітини HaCaT як надійна модель диференціації in vitro для вивчення запальної/репаративної відповіді кератиноцитів людини. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp P. та ін. Нормальна кератинізація в спонтанно імморталізованій анеуплоїдній клітинній лінії кератиноцитів людини. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Гіббс, Грем: Аналіз якісних даних. Набір для якісних досліджень Sage. Лондон: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Хедрік Т.Е., Бікман Л., Рог Д.Д. 1993. Дизайн прикладних досліджень: практичний посібник. Sage: London
11. Boukamp P. Петрусевська Р. Т. Брайткрейц Д. Хорнунг Я. Маркхем А. Фусеніг Н. Е. Нормальна кератинізація у спонтанно імморталізованій анеуплоїдній клітинній лінії кератиноцитів людини. Cell Biol.(1988);106:761-771.