Celice HaCaT - Raziskovanje biologije kože in bolezni

2.genetske značilnosti in izvor celic HaCaT

Celice HaCaT so spontano imortalizirana celična linija človeških keratinocitov, ki izvirajo iz kože odraslih in predstavljajo edinstveno evolucijsko pot. Te celice imajo mutacije v obeh alelih gena p53, kar je značilno za mutacije, ki jih povzroča UV-sevanje [3,4]. Poleg tega se domneva, da so celice HaCaT nastale z mutacijami tumorskega supresorskega gena p53, čemur je sledila izguba genov senescence [5].

Tumorski supresorski gen p53, ki je znan po svoji vlogi pri popravljanju DNK in kot varuh genoma, povzroča odziv človeške kože na poškodbe DNK [4]. Opazili so, da so celice HaCaT zaradi mutacije gena p53 in vivo delno izgubile zaščitni mehanizem pred poškodbami DNK, zaradi česar so dovzetne za kopičenje citogenetskih sprememb kot odziv na povišano temperaturo kulture. Drug mehanizem nesmrtnosti celic HaCaT vključuje povečano aktivnost encima telomeraze [7]. V normalnih celicah se telomere z vsako celično delitvijo nenehno krajšajo, dokler ne dosežejo celične senescence. Telomeraza je specializiran celični encimski kompleks z aktivnostjo povratne transkriptaze, ki vzdržuje stabilno dolžino telomer. V nasprotju s tem pa celice HaCaT kažejo znatno povečano aktivnost telomeraze, kar ima za posledico dobro ohranjeno dolžino telomer. Ta opažanja potrjujejo vlogo telomeraze v procesu nesmrtnosti celic HaCaT.

Ugotovljene so bile tri specifične kromosomske translokacije, ki povzročijo izgubo ene kopije kromosomskih krakov 3p, 4p in 9p, pridobitev kraka 9q in nastanek izohromosomov. Izguba kratkega kraka kromosoma 3p lahko povzroči izgubo genov za staranje in nesmrtnost celic HaCaT [8]. Celice HaCaT so hipodiploidne ter imajo ločene in stabilne označevalne kromosome, ki predstavljajo njihov monoklonski izvor. Značilnosti in glava celične linije HaCaT so bile potrjene z uporabo prstnih odtisov DNK s hipervariabilnimi minisatelitnimi označevalci [3-6].

3.kako pridobiti celice HaCaT v 5 preprostih korakih

4. Odstranite gojišče in sperite prilepljene celice s 3-5 ml PBS brez kalcija in magnezija za bučke T25 ali 5-10 ml za bučke T75.
5. Dodajte 1-2 ml sveže pripravljene 0,05-odstotne raztopine EDTA na bučko T25 ali 2,5 ml na bučko T75, tako da je pokrit celoten celični list, in inkubirajte pri 37 °C 10 minut.
6. Dodajte 1 mL sveže pripravljene raztopine tripsina/EDTA (0,05 %/0,025 %) na bučko T25 ali 2,5 mL na bučko T75, pri čemer ponovno poskrbite, da je celični list popolnoma prekrit. Celice se morajo ločiti v 1-2 minutah.
7. Aktivnost tripsina ustavite z dodajanjem gojišča za gojenje celic, ki vsebuje FBS.
8. Celice prelijte v nove erlenmajerice s svežim gojiščem za gojenje celic.

4. Uporaba celic HaCaT

Celice HaCaT so dragoceno orodje za preučevanje keratinocitov [9]. Te nesmrtne celice delujejo kot preneoplastične celice in lahko omogočijo vpogled v spremembe, povezane z maligno in neoplastično transformacijo [10]. Enoslojne celične kulture HaCaT so bistvene za aplikacije za analizo celične toksičnosti in in vitro celjenja ran. Celice HaCaT se lahko uporabljajo tudi za ocenjevanje toksičnosti za kožo, ki jo povzročajo različni dejavniki in neoplastični ali vnetni procesi. Uporabimo jih lahko za analizo različnih mehanizmov kožnih alergijskih reakcij, učinkov reaktivnih kisikovih vrst in obsevanja z UV-žarki. Po stimulaciji se lahko celice HaCaT diferencirajo in izražajo specifične diferenciacijske markerje, kot so involucrin, K14 in K10. Celice HaCaT se pogosto uporabljajo tudi kot model za preučevanje patofiziologije epidermalne homeostaze [6].

Celice HaCaT po presaditvi ohranijo zmožnost obnove strukturiranega epidermisa in vivo, kar povzroči stratificirano epidermalno strukturo, ki jo je mogoče spreminjati med bazičnim in diferenciranim stanjem s spremembami koncentracije kalcija v mediju. Te celice omogočajo tudi karakterizacijo več bioloških procesov, na primer uporabo kot modelni sistem za vitamin D in presnovo v koži. Ker celice HaCaT niso gensko spremenjene, predstavljajo nepristranski pogled na širok spekter začetnih genetskih dogodkov v človeški koži.

5. Priporočeni videoposnetki: Videoposnetki: Raziskovanje sveta celic HaCaT

"Migracija celic HaCaT": Ta videoposnetek prikazuje proces migracije celic v celicah HaCaT. Migracija celic je bistven proces za različne biološke procese, kot sta celjenje ran in metastaziranje raka. Video prikazuje gibanje celic HaCaT pod mikroskopom, kar omogoča vizualni prikaz, kako te celice migrirajo. Med premikanjem celic z enega mesta na drugo opazujemo njihovo aktivnost, videoposnetek pa jasno prikazuje spremembe, ki se med tem procesom zgodijo v celicah.

"Preskus praskanja na celicah HaCaT": V tem videoposnetku je prikazan test praskanja, izveden na celicah HaCaT. Preskus Scratch Assay je pogosto uporabljena tehnika za preučevanje migracije celic, v tem primeru pa se uporablja za analizo migracije celic HaCaT. Videoposnetek prikazuje postopek ustvarjanja praske na površini posode za gojenje celic, ki se nato opazuje pod mikroskopom, ko celice HaCaT migrirajo in sčasoma zapolnijo vrzel.

"Rast celic keratinocitov HaCaT za poskuse celjenja ran": Ta videoposnetek prikazuje postopek celične rasti keratinocitov HaCaT za poskuse celjenja ran. Keratinociti HaCaT so pogosto uporabljena celična linija v študijah celjenja ran.

"Diferenciacija celic HaCaT": Ta videoposnetek prikazuje potrebne korake za diferenciacijo celic HaCaT. Celice HaCaT se lahko diferencirajo v različne vrste kožnih celic. Videoposnetek prikazuje spremembe celic HaCaT med diferenciacijo, pri čemer so vizualno prikazani različni označevalci in značilnosti diferenciacije. Proces diferenciacije je ključnega pomena za normalno delovanje kože, v videoposnetku pa so poudarjene različne stopnje diferenciacije, ki jih prestanejo celice HaCaT.

Reference

1. Angel P in Karin M: Vloga Jun, Fos in kompleksa AP-1 pri proliferaciji in transformaciji celic. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Izolacija in karakterizacija spontano nastale dolgožive linije človeških keratinocitov (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: Mutacije p53 v človeških imortaliziranih epitelijskih celičnih linijah. Kancerogeneza 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutacijska žarišča zaradi sončne svetlobe v genu p53 nemelanomskega kožnega raka. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R in drugi. celice HaCaT kot zanesljiv in vitro diferenciacijski model za razčlenjevanje vnetnega/obnovitvenega odziva človeških keratinocitov. mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontano immortalized aneuploid human keratinocyte cell line (Normalna keratinizacija v spontano imortalizirani aneuploidni liniji človeških keratinocitov) J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Gibbs, G.: Analysing qualitative data (Analiza kvalitativnih podatkov). The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Applied research design: a practical guide. Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normalna keratinizacija v spontano imortalizirani aneuploidni celični liniji človeških keratinocitov. Cell Biol.(1988);106:761-771.