Objavljeno: 2023 | Zadnji pregled: maj 2026
Celovit vodnik po zamrzovanju celic: zagotavljanje vitalnosti in sterilnosti
Zamrzovanje celic je ključni proces pri upravljanju celičnih kultur, ki zagotavlja dolgoročno shranjevanje in ohranjanje dragocenih celičnih linij. Ne glede na to, ali delate s človeškimi ali živalskimi celicami, je za uspešno krioprezervacijo nujno upoštevati natančne protokole in strogo upoštevati aseptične tehnike.
Ta vodnik vsebuje podrobna navodila o potrebnih materialih, reagentih in postopkih po korakih za učinkovito zamrzovanje celic ob ohranjanju njihove vitalnosti in sterilnosti. S spoštovanjem teh smernic lahko raziskovalci z zaupanjem shranijo in kasneje oživijo celične kulture z minimalno izgubo vitalnosti celic, pri čemer ohranijo celovitost in zanesljivost svojih eksperimentalnih rezultatov.
Za začetek je bistveno vzpostaviti sterilno delovno okolje. Ustrezne aseptične tehnike igrajo ključno vlogo pri preprečevanju kontaminacije in zagotavljanju sterilnosti kultur.
Aseptična tehnika
Ves čas postopka upoštevajte aseptične tehnike, da zagotovite sterilnost kultur.
Celovit postopek zamrzovanja celic
Ta diagram poteka ponuja podrobna vizualna navodila za bistvene korake, potrebne za pravilno zamrzovanje celic. Upoštevajte te postopke, da zagotovite visoko vitalnost in celovitost celic med postopkom krioprezervacije.
Priprava sredstva za zamrzovanje
Pripravite krioprotektivno zamrzovalno sredstvo glede na vrsto celic:
- Kulture v medijih, ki vsebujejo FBS: 90 % FBS + 10 % DMSO ali 70 % rastnega medija, 20 % FBS in 10 % DMSO
- Celice, ki potrebujejo glicerol: 90 % FBS + 10 % glicerola
Razmislite o nakupu našega vnaprej pripravljenega sredstva za zamrzovanje:
- Sredstvo za zamrzovanje CM-1: Za protokole, ki zahtevajo sredstvo, ki vsebuje fetalno goveje serum (FBS)
- Sredstvo za zamrzovanje CM-ACF – brez seruma: za alternativo brez FBS
Označevanje in dokumentacija
Označite krioviale z naslednjimi podatki:
- Datum
- Ime raziskovalca
- Številka celic
- Številka pasaže
- Tip celic
- Morebitne dodatne informacije (npr. genske spremembe)
Priprava celic
Za adhezivne celice:
- Spremljajte celice, dokler ne dosežejo 85–95 % konfluence
- Odsesajte staro gojišče
- Izperite celični monosloj s PBS brez kalcija in magnezija
- Odstranite celice z Accutase, tripsinom ali tripsinom-EDTA in po potrebi nevtralizirajte s kultivnim medijem
- Suspenzijo celic prenesite v 50-mililitrsko Falconovo epruveto
Za celice v suspenziji:
- Preverite gostoto in zdravstveno stanje celic pod mikroskopom
- Suspenzijo celic prenesite neposredno v 50-mililitrsko epruveto Falcon
Štetje celic in centrifugiranje
- Štejte celice s hemocitometrom ali avtomatskim števcem celic
- Centrifugirajte pri 300 g 3–5 minut pri sobni temperaturi, da se celice usedejo
- Previdno odsesajte supernatant, pri tem pa pazite, da ne motite celičnega peleta
- Pripravljeno zamrzovalno sredstvo pred uporabo segrejte na 37 °C
Krioprezervacija
- Pelet celic ponovno suspendirajte v zamrzovalnem mediju do gostote 2,0 milijona celic/ml za adhezivne celice in 5 milijonov celic/ml za suspenzijske celice ali do želene koncentracije
- Odmerite 1,0 ml (ali več, če je potrebno) celične suspenzije v označene kriovialke
- Pred prenosom celic v dolgoročno shranjevanje uporabite metodo počasnega zamrzovanja
- ? Metoda
- ? Koraki
-
❄️
Ročno zamrzovanje -
1️⃣ Celice v zamrzovalnem mediju postavite v zamrzovalnik pri 4 °C za 40 minut.
2️⃣ Prenesite v zamrzovalnik pri -80 °C za 24 ur.
3️⃣ Celice shranite v tekočem dušiku za dolgoročno shranjevanje. -
?
Uporaba Mr. Frosty -
1️⃣ Pripravite celice v kriovialkah z zamrzovalnim medijem.
2️⃣ Kriovialke postavite v posodo Mr. Frosty.
3️⃣ Shranite pri -80 °C za 24 ur, preden jih prenesete v tekoči dušik. -
?
Zamrzovalnik z nadzorovano hitrostjo -
1️⃣ Napravo nastavite tako, da se temperatura postopoma znižuje.
2️⃣ Pripravljene celice postavite v zamrzovalnik.
3️⃣ Po končanem ciklu zamrzovanja celice prenesite v tekoči dušik.
- Krioviale shranite pri temperaturah pod -130 °C ali v tekočem dušiku za dolgoročno shranjevanje.
Materiali in reagenti
- 1–2 ml kriovial
- Zamrzovalna enota CoolCell® ali zamrzovalnik z nadzorovano hitrostjo
- Krioprotektivno zamrzovalno sredstvo (npr. krioprotektivna sredstva za domačo pripravo, CM-1, CM-ACF ali specializirana sredstva)
- Fetalno goveje serum (FBS) ali kondicionirana sredstva
- DMSO ali glicerol
- PBS brez kalcija in magnezija
- Accutase, tripsin ali tripsin-EDTA (za adhezivne celice)
- 15 ml ali 50 ml Falconove epruvete
- Hemocitometer ali avtomatski števec celic
- Centrifuga