Izčrpen vodnik za zamrzovanje celic: Zagotavljanje vitalnosti in sterilnosti
Zamrzovanje celic je ključni postopek pri upravljanju celičnih kultur, ki zagotavlja dolgoročno shranjevanje in ohranjanje dragocenih celičnih linij. Ne glede na to, ali gre za delo s človeškimi ali živalskimi celicami, sta upoštevanje natančnih protokolov in vzdrževanje strogih aseptičnih tehnik najpomembnejša za uspešno kriokonzervacijo.
Ta priročnik vsebuje podrobna navodila o potrebnih materialih, reagentih in postopkih po korakih za učinkovito zamrzovanje celic ob ohranjanju njihove vitalnosti in sterilnosti. Z upoštevanjem teh navodil lahko raziskovalci z gotovostjo shranjujejo in pozneje oživijo celične kulture z minimalno izgubo vitalnosti celic ter ohranijo celovitost in zanesljivost svojih eksperimentalnih rezultatov.
Za začetek je treba vzpostaviti sterilno delovno okolje. Ustrezne aseptične tehnike imajo ključno vlogo pri preprečevanju kontaminacije in zagotavljanju sterilnosti kultur.
Aseptična tehnika
Med postopkom upoštevajte aseptične tehnike, da zagotovite sterilnost kultur.
Celovit postopek zamrzovanja celic
Ta diagram poteka zagotavlja podroben vizualni vodnik po bistvenih korakih, ki so vključeni v pravilno zamrzovanje celic. Z upoštevanjem teh postopkov zagotovite visoko vitalnost in celovitost celic med postopkom kriokonzervacije.
Priprava medija za zamrzovanje
Pripravite krioprotektivno gojišče za zamrzovanje glede na vrsto celic:
- Kultura z medijem, ki vsebuje FBS: 90 % FBS + 10 % DMSO ali 70 % rastnega gojišča, 20 % FBS in 10 % DMSO
- Celice, ki potrebujejo glicerol: 90 % FBS + 10 % glicerola
Razmislite o nakupu našega vnaprej pripravljenega gojišča za zamrzovanje:
- Za protokole,ki zahtevajo gojišče,ki vsebuje fetalni goveji serum (FBS)
- Gojišče za zamrzovanje CM-ACF - brez seruma: Za alternativo brez FBS
Označevanje in dokumentacija
Kriovile označite z naslednjimi podatki:
- Datum
- Ime raziskovalca
- Številka celice
- Številka prehoda
- Vrsta celice
- Vse dodatne informacije (npr. genske spremembe)
Priprava celic
Za adherentne celice:
- Spremljajte celice, dokler ne dosežejo 85-95-odstotne konfluence
- Aspirirajte staro gojišče
- Izperite celični monosloj s PBS brez kalcija in magnezija
- Odcepite celice z akutazo, tripsinom ali tripsin-EDTA in jih po potrebi nevtralizirajte z gojiščem
- Celično suspenzijo prenesite v 50-mililitrsko epruveto Falcon
Za suspenzijske celice:
- Preverite gostoto in zdravje celic pod mikroskopom
- Prenesite celično suspenzijo neposredno v 50 mL Falconovo epruveto
Štetje celic in centrifugiranje
- Preštejte celice s hemocitometrom ali avtomatskim števcem celic
- Centrifugirajte pri 300 g 3 do 5 minut pri sobni temperaturi, da bi se celice zbrusile
- Previdno aspirirajte supernatant, pri čemer se izogibajte motnjam celične pelete
- Pred uporabo pripravljeno gojišče za zamrzovanje segrejte na 37 °C
Krioprezervacija
- Ponovno suspendirajte celični pelet v mediju za zamrzovanje do gostote 2,0 milijona celic/ml za adherentne celice in 5 milijonov celic/ml za suspenzijske celice ali do želene koncentracije
- 1,0 ml (ali več po potrebi) celične suspenzije alikvotno razdelite v označene kriovile
- Pred prenosom celic v dolgoročno skladiščenje uporabite metodo počasnega zamrzovanja
| ? Metoda | ? Koraki |
|---|---|
|
❄️ Ročno zamrzovanje |
1️⃣ Postavite celice v zamrzovalno sredstvo v zamrzovalnik pri 4 °C za 40 minut. 2️⃣ Za 24 ur prenesite v zamrzovalnik pri -80 °C. 3️⃣ Za dolgoročno shranjevanje shranite celice v tekočem dušiku |
|
? Uporaba pripomočka Mr. Frosty |
1️⃣ Pripravite celice v kriovile z gojiščem za zamrzovanje. 2️⃣ Kriovile postavite v posodo Mr. Frosty. 3️⃣ Pred prenosom v tekoči dušik jih 24 ur hranite pri -80 °C |
|
? Zamrzovalnik z nadzorovano hitrostjo |
1️⃣ Napravo sprogramirajte za postopno zniževanje temperature. 2️⃣ Pripravljene celice postavite v zamrzovalnik. 3️⃣ Po ciklu zamrzovanja celice prenesite v tekoči dušik |
- Kriovile shranite pri temperaturi pod -130 °C ali v tekočem dušiku za dolgotrajno shranjevanje.
Materiali in reagenti
- 1-2 mL kriovialov
- Enota za zamrzovanje CoolCell® ali zamrzovalnik z nadzorovano hitrostjo
- Krioprotektivno sredstvo za zamrzovanje (npr. krioprotektivno sredstvo DIY, CM-1, CM-ACF ali specializirano sredstvo)
- Fetalni goveji serum (FBS) ali kondicionirani mediji
- DMSO ali glicerol
- PBS brez kalcija in magnezija
- Akutaza, tripsin ali tripsin-EDTA (za adherentne celice)
- 15- ali 50-mililitrske epruvete Falcon
- Hemocitometer ali avtomatski števec celic
- Centrifuga