Tehnike disociacije celičnih kultur

Disociacija celičnih kultur je ključni korak pri vzdrževanju celičnih kultur. Vključuje ločitev celic od njihove rastne površine, da se omogoči subkultiviranje ali pobiranje. V tem razdelku sta opisani dve glavni metodi: uporaba pufrov za disociacijo brez encimov in uporaba encimskih reagentov.

1.uporaba pufrov za disociacijo celic brez encimov

Ta metoda je nežna in ohranja celično celovitost brez uporabe encimov:

1. Priprava
   • Pred uporabo vse reagente segrejte na 37 °C, da preprečite šok za celice.
2. Odstranitev rastnega medija
   • Iz posode za gojenje odstranite staro rastno gojišče.
3. Izpiranje
   • Izperite celične monosloje s 5 ml PBS brez kalcija in magnezija na bučko T75 ali 100 mm krožnik.
   • Posodo nežno zibajte 30 do 60 sekund pri sobni temperaturi.
   • Raztopino za izpiranje odsesajte in zavrzite.
   • Ta korak izpiranja ponovite še enkrat.
4. Disociacija
   • V posodo dodajte približno 5 ml pufra za disociacijo celic brez encimov.
   • Nežno zibajte pri sobni temperaturi 1 do 2 minuti in preverite disociacijo pod mikroskopom.
   • Če je potrebno, z bučko ali posodo udarite ob roko, da se celice premaknejo.
   • Če so celice prilepljene, jih pustite stati na sobni temperaturi še 2 do 5 minut in jih po potrebi ponovno pokukajte, pri čemer uporabite več disociacijskega pufra.
   • Ko so celice ločene, dodajte vsaj 5 ml popolnega rastnega gojišča, da nevtralizirate disociacijski pufr in ponovno suspendirate celice.
5. Preverjanje vitalnosti
   • Med subkultiviranjem spremljajte vitalnost celic in poskrbite, da je nad 90 %.

2.uporaba drugih reagentov za disociacijo

Ta metoda omogoča uporabo različnih reagentov za disociacijo:

1. Odstranjevanje uporabljenega medija
   • Iz posode za gojenje odstranite staro gojišče.
2. Pranje celic
   • Celice sperite z uravnoteženo raztopino soli brez kalcija in magnezija ali uporabite EDTA.
   • Raztopino za izpiranje previdno dodajte na stran nasproti celic in posodo zibajte 1 do 2 minuti, preden jo zavržete.
3. Disociacija
   • Na 25 cm² rastne površine nanesite 2 do 3 ml izbrane raztopine za disociacijo, pri čemer poskrbite, da je celični list pokrit.
   • Posodo inkubirajte pri 37 °C in jo nežno zibajte. Disociacija se običajno izvede v 5 do 15 minutah, odvisno od celične linije.
   • Pri trdovratnih celicah lahko postopek pospešite s tapkanjem po posodi.
   • Pazljivo opazujte celice, da preprečite preveliko izpostavljenost in morebitne poškodbe.
4. Pobiranje celic
   • Ko so celice popolnoma ločene, jim omogočite, da se zberejo na dnu posode, tako da jo postavite pokonci.
   • Dodajte popolno gojišče, nato pa celice razpršite in jih poberite s pipeto nad celično plastjo.
   • Preštejte jih in nadaljujte s subkultivacijo.

Pri obeh metodah je pomembno, da z empiričnim opazovanjem določite optimalne pogoje za posamezno celično linijo. Postopek mora ohraniti vitalnost celic, ki jo je treba rutinsko preverjati, da med subkultiviranjem presega 90 %. Ti postopki so osnova, ki jo lahko raziskovalci prilagodijo glede na posebne zahteve in značilnosti svojih celičnih linij.

3.pregled tehnik za subkultiviranje adherentnih celic

Za učinkovito subkultiviranje adherentnih celic je treba te ločiti od posode za gojenje. Uporabljajo se različne metode, ki so primerne za različne vrste celic in pogoje. Pri izbiri metode ločitve je treba upoštevati posebne potrebe celične linije in cilje poskusa. Redno spremljanje viabilnosti celic, pri čemer je cilj, da je ob subkultiviranju več kot 90 %, bistvenega pomena za nadaljnje zdravje in produktivnost kulture. Tukaj je pregled teh postopkov: