Objavljeno: 2023 | Zadnji pregled: maj 2026

Tehnike disociacije celičnih kultur

Disociacija celične kulture je ključni korak pri vzdrževanju celične kulture. Vključuje ločevanje celic od njihove rastišča, da se omogoči subkultiviranje ali pobiranje. Ta poglavje opisuje dve glavni metodi: uporabo pufrov za disociacijo brez encimov in uporabo encimskih reagentov.

Uporaba pufrov za disociacijo celic brez encimov

Ta metoda je nežna in ohranja celično integriteto brez uporabe encimov:

1. Priprava
   • Prepričajte se, da so vsi reagenti pred uporabo ogreti na 37 °C, da se izognete šoku za celice.
2. Odstranjevanje gojišča:
   • Iz posode za gojenje odstranite staro gojišče.
3. Izpiranje
   • Izperite celične monosloje s 5 ml PBS brez kalcija in magnezija na posodo T75 ali 100 mm pladenj.
   • Posodo nežno stresajte 30 do 60 sekund pri sobni temperaturi.
   • Odsesajte in zavrzite raztopino za izpiranje.
   • Ta korak izpiranja ponovite še enkrat.
4. Disociacija
   • V posodo dodajte približno 5 ml pufra za disociacijo celic brez encimov.
   • Posodo nežno potresajte pri sobni temperaturi 1 do 2 minuti in pod mikroskopom preverite, ali je prišlo do disociacije.
   • Po potrebi s tapkanjem kolbe ali posode ob roko odstranite celice.
   • Če so celice prilepljene, jih pustite stati pri sobni temperaturi še 2 do 5 minut in po potrebi ponovno potrkajte, pri čemer uporabite več pufra za disociacijo.
   • Ko se celice ločijo, dodajte vsaj 5 ml popolnega gojišča, da nevtralizirate puf za disociacijo in ponovno suspendirate celice.
5. Preverjanje vitalnosti
   • Med subkultiviranjem spremljajte vitalnost celic in poskrbite, da ostane nad 90 %.

Uporaba drugih reagentov za disociacijo

Ta metoda omogoča uporabo različnih reagentov za disociacijo:

1. Odstranjevanje uporabljenega gojišča
   • Staro gojišče izpraznite iz posode za gojenje.
2. Pranje celic
   • Celice sperite z uravnoteženo solno raztopino brez kalcija in magnezija ali uporabite EDTA.
   • Pralno raztopino previdno dodajte na stran, nasprotno celicam, in posodo 1 do 2 minuti rahlo pretresajte, preden pralno raztopino zavržete.
3. Disociacija
   • Na 25 cm² površine za rast nanesite 2 do 3 ml izbrane raztopine za disociacijo in poskrbite, da je celotna površina celic pokrita.
   • Posodo inkubirajte pri 37 °C in nežno potresajte. Disociacija običajno poteka v 5 do 15 minutah, odvisno od celične linije.
   • Pri trdovratnih celicah lahko postopek pospešite s tapkanjem po posodi.
   • Celice pazljivo opazujte, da preprečite prekomerno izpostavljenost in morebitno poškodbo.
4. Pobiranje celic
   • Ko so celice popolnoma ločene, jih pustite, da se zberejo na dnu posode, tako da jo postavite pokonci.
   • Dodajte popolno gojišče, nato razporedite in zberite celice s pipetiranjem po celičnem sloju.
   • Preštejte celice in nadaljujte s subkultiviranjem.

Pri obeh metodah je pomembno, da z empiričnim opazovanjem določite optimalne pogoje za vsako celično linijo. Postopek mora ohraniti vitalnost celic, ki jo je treba med subkultiviranjem redno preverjati, da presega 90 %. Ti postopki zagotavljajo osnovo, ki jo lahko raziskovalci prilagodijo glede na posebne zahteve in značilnosti svojih celičnih linij.

Pregled tehnik za subkultiviranje adhezivnih celic

Za učinkovito subkultiviranje adhezivnih celic je potrebno njihovo ločevanje od kultivnega posoda. Uporabljajo se različne metode, vsaka primerna za različne vrste celic in pogoje. Pri izbiri metode disociacije je ključno upoštevati specifične potrebe celične linije in cilje poskusa. Redno spremljanje vitalnosti celic, s ciljem, da ta v času subkultiviranja presega 90 %, je bistveno za ohranjanje zdravja in produktivnosti kulture. Tukaj je pregled teh postopkov: