Guia completo de congelação de células: Garantir a Viabilidade e Esterilidade
O congelamento de células é um processo crítico na gestão de culturas celulares, garantindo o armazenamento a longo prazo e a preservação de linhas celulares valiosas. Quer se trabalhe com células humanas ou animais, seguir protocolos precisos e manter técnicas assépticas rigorosas é fundamental para conseguir uma criopreservação bem sucedida.
Este guia fornece instruções detalhadas sobre os materiais, reagentes e procedimentos passo a passo necessários para congelar eficazmente as células, preservando a sua viabilidade e esterilidade. Ao aderir a estas diretrizes, os investigadores podem armazenar com confiança e mais tarde reavivar culturas de células com uma perda mínima de viabilidade celular, mantendo a integridade e fiabilidade dos seus resultados experimentais.
Para começar, é essencial estabelecer um ambiente de trabalho estéril. As técnicas assépticas adequadas desempenham um papel crucial na prevenção da contaminação e na garantia da esterilidade das culturas.
Técnica asséptica
Siga as técnicas assépticas durante todo o processo para garantir a esterilidade das culturas.
Processo abrangente de congelação de células
Este fluxograma fornece um guia visual pormenorizado para os passos essenciais envolvidos na congelação correta das células. Siga estes procedimentos para garantir uma elevada viabilidade e integridade das células durante o processo de criopreservação.
Preparação do meio de congelação
Preparar o meio de congelação crioprotector de acordo com o tipo de célula:
- Culturas em meio contendo FBS: 90% de FBS + 10% de DMSO ou 70% de meio de crescimento, 20% de FBS e 10% de DMSO
- Células que requerem glicerol: 90% FBS + 10% glicerol
Considerar a aquisição do nosso meio de congelação pré-formulado:
- Freeze Medium CM-1: Para protocolos que requerem um meio que contenha Soro Fetal Bovino (FBS)
- Meio de congelação CM-ACF - sem soro: Para uma alternativa sem FBS
Rotulagem e documentação
Rotular os frascos criogénicos com os seguintes detalhes:
- Data
- Nome do investigador
- Número da célula
- Número de passagem
- Tipo de célula
- Qualquer informação adicional (por exemplo, modificações genéticas)
Preparação das células
Para células aderentes:
- Monitorizar as células até atingirem 85-95% de confluência
- Aspirar o meio de cultura antigo
- Lavar a monocamada de células com PBS sem cálcio e magnésio
- Separar as células com Accutase, tripsina ou tripsina-EDTA e neutralizar com meio de cultura, se necessário
- Transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 50 ml
Para células em suspensão:
- Verificar a densidade e a saúde das células num microscópio
- Transferir a suspensão de células diretamente para um tubo Falcon de 50 ml
Contagem e centrifugação de células
- Contar as células utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado
- Centrifugar a 300 g durante 3-5 minutos à temperatura ambiente para sedimentar as células
- Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, evitando perturbar o pellet de células
- Aquecer o meio de congelação preparado a 37°C antes de o utilizar
Criopreservação
- Ressuspender o pellet de células em meio de congelação até uma densidade de 2,0 milhões de células/mL para células aderentes e 5 milhões de células/mL para células em suspensão, ou a concentração desejada
- Alíquota de 1,0 mL (ou mais, conforme necessário) da suspensão de células para frascos criogénicos rotulados
- Utilize um método de congelação lenta antes de transferir as células para armazenamento a longo prazo
| ? Método | ? Passos |
|---|---|
|
❄️ Congelação manual |
1️⃣ Colocar as células em meio de congelação num congelador a 4°C durante 40 minutos. 2️⃣ Transferir para um congelador a -80°C durante 24 horas. 3️⃣ Armazenar as células em azoto líquido para preservação a longo prazo |
|
? Utilizar o Mr. Frosty |
1️⃣ Preparar as células em frascos criogénicos com meio de congelação. 2️⃣ Colocar os frascos criogénicos no recipiente Mr. Frosty. 3️⃣ Armazenar a -80°C durante 24 horas antes de transferir para azoto líquido |
|
? Congelador de velocidade controlada |
1️⃣ Programar o dispositivo para diminuir gradualmente a temperatura. 2️⃣ Coloque as células preparadas no congelador. 3️⃣ Após o ciclo de congelação, transfira as células para azoto líquido |
- Armazenar os frascos criogénicos a temperaturas inferiores a -130°C ou em azoto líquido para preservação a longo prazo.
Materiais e reagentes
- frascos para criogénios de 1-2 mL
- Unidade de congelação CoolCell® ou congelador de velocidade controlada
- Meio de congelação crioprotector (por exemplo, meio crioprotector DIY, CM-1, CM-ACF ou meios especializados)
- Soro Fetal Bovino (FBS) ou meio condicionado
- DMSO ou glicerol
- PBS sem cálcio e magnésio
- Accutase, Tripsina ou Tripsina-EDTA (para células aderentes)
- tubos Falcon de 15 ml ou 50 ml
- Hemocitómetro ou contador automático de células
- Centrifugadora