Publicado: 2023 | Última revisão: maio de 2026

Guia Completo para o Congelamento de Células: Garantindo a Viabilidade e a Esterilidade

O congelamento de células é um processo crítico na gestão de culturas celulares, garantindo o armazenamento e a preservação a longo prazo de valiosas linhas celulares. Quer se trabalhe com células humanas ou animais, seguir protocolos precisos e manter técnicas assépticas rigorosas é fundamental para alcançar uma criopreservação bem-sucedida.

Este guia fornece instruções detalhadas sobre os materiais e reagentes necessários, bem como procedimentos passo a passo para congelar células de forma eficaz, preservando a sua viabilidade e esterilidade. Ao seguir estas diretrizes, os investigadores podem armazenar e posteriormente reativar culturas celulares com confiança, com perda mínima de viabilidade celular, mantendo a integridade e a fiabilidade dos seus resultados experimentais.

Para começar, é essencial estabelecer um ambiente de trabalho estéril. Técnicas assépticas adequadas desempenham um papel crucial na prevenção da contaminação e na garantia da esterilidade das culturas.

Técnica Asséptica

Siga as técnicas assépticas ao longo de todo o processo para garantir a esterilidade das culturas.

Processo abrangente de congelamento de células

Este fluxograma fornece um guia visual detalhado das etapas essenciais envolvidas no congelamento adequado de células. Siga estes procedimentos para garantir alta viabilidade e integridade celular durante o processo de criopreservação.

Preparação do meio de congelamento

Prepare o meio de congelamento crioprotetor de acordo com o tipo de célula:

Culturas em meios contendo FBS: 90% de FBS + 10% de DMSO ou 70% de meio de crescimento, 20% de FBS e 10% de DMSO
Células que requerem glicerol: 90% de FBS + 10% de glicerol

Considere adquirir o nosso meio de congelamento pré-formulado:

Meio de congelação CM-1: Para protocolos que requerem um meio contendo soro fetal bovino (FBS)
Meio de congelamento CM-ACF - sem soro: Para uma alternativa sem FBS

Etiquetagem e documentação

Rotule os criotubos com os seguintes detalhes:

Data
Nome do investigador
Número da célula
Número de passagem
Tipo de célula
Quaisquer informações adicionais (por exemplo, modificações genéticas)

Preparação celular

Para células aderentes:

Monitorize as células até atingirem 85–95% de confluência
Aspirar o meio de cultura antigo
Enxaguar a monocamada celular com PBS isento de cálcio e magnésio
Descolar as células com Accutase, tripsina ou tripsina-EDTA e neutralizar com meio de cultura, se necessário
Transfira a suspensão celular para um tubo Falcon de 50 mL

Para células em suspensão:

Verifique a densidade e o estado das células ao microscópio
Transfira a suspensão celular diretamente para um tubo Falcon de 50 mL

Contagem de células e centrifugação

Conte as células utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automático
Centrifugue a 300 g durante 3-5 minutos à temperatura ambiente para sedimentar as células
Aspirar o sobrenadante com cuidado, evitando perturbar o sedimento celular
Aqueça o meio de congelamento preparado a 37 °C antes de utilizar

Criopreservação

Resuspender o sedimento celular no meio de congelamento até uma densidade de 2,0 milhões de células/mL para células aderentes e 5 milhões de células/mL para células em suspensão, ou a concentração desejada
Alíquotar 1,0 mL (ou mais, conforme necessário) da suspensão celular em criotubos rotulados
Utilize um método de congelamento lento antes de transferir as células para armazenamento a longo prazo

? Método: ? Passos
❄️ Congelamento manual: 1️⃣ Coloque as células no meio de congelamento num congelador a 4 °C durante 40 minutos.
2️⃣ Transfira para um congelador a -80 °C durante 24 horas.
3️⃣ Armazene as células em nitrogénio líquido para conservação a longo prazo.
? Utilizando o Mr. Frosty: 1️⃣ Prepare as células em criotubos com meio de congelamento.
2️⃣ Coloque os criotubos no recipiente Mr. Frosty.
3️⃣ Armazene a -80 °C durante 24 horas antes de transferir para nitrogénio líquido.
? Congelador de taxa controlada: 1️⃣ Programe o dispositivo para diminuir gradualmente a temperatura.
2️⃣ Coloque as células preparadas no congelador.
3️⃣ Após o ciclo de congelamento, transfira as células para nitrogénio líquido.

Armazene os criotubos a temperaturas inferiores a -130 °C ou em nitrogénio líquido para conservação a longo prazo.

Materiais e reagentes

Criotubos de 1–2 mL
Unidade de congelamento CoolCell® ou congelador de taxa controlada
Meio de congelamento crioprotetor (por exemplo, meios crioprotetores DIY, CM-1, CM-ACF ou meios especializados)
Soro fetal bovino (FBS) ou meios condicionados
DMSO ou glicerol
PBS sem cálcio e magnésio
Accutase, tripsina ou tripsina-EDTA (para células aderentes)
Tubos Falcon de 15 mL ou 50 mL
Hemocitómetro ou contador de células automático
Centrífuga