Células HuH7: Uma porta de entrada para a investigação sobre o hepatoma e o VHC

A linha celular HuH7, derivada de um hepatoma humano, representa uma coleção imortalizada de células tumorigénicas de tipo epitelial. Esta linha, juntamente com as suas derivadas HuH7.5 e HuH7.5.1, serve como um substituto prático dos hepatócitos primários em contextos experimentais. É predominantemente utilizada em modelos de cultura celular para investigar a infeção pelo vírus da hepatite C (VHC) e a fisiopatologia do hepatoma.

Origem e características das células HuH-7

É essencial compreender as origens, as principais características e as condições de cultura ideais da linha celular HuH7 antes da sua aplicação na investigação.

A linha celular HuH7 foi estabelecida por Sato, J, e Nakabayshi, H, em 1982, derivada de uma linhagem de cancro hepatocitário altamente diferenciada. Foi originalmente obtida a partir de um carcinoma hepatocelular num homem japonês de 57 anos. Caracterizadas pela sua capacidade de produzir várias substâncias fisiologicamente relevantes, tais como a albumina e a alfa-fetoproteína, as células HuH7 apresentam uma elevada suscetibilidade à infeção pelo VHC, tornando-as adequadas para utilização em sistemas de replicões do VHC. Esta característica torna a linha celular valiosa para o rastreio e desenvolvimento de terapêuticas anti-VHC. As células HuH7 apresentam uma morfologia de tipo epitelial, com uma forma hexagonal, e aderem às superfícies para formar monocamadas 2D durante o crescimento. Em média, as células HuH7 têm um diâmetro de 21,9 µm, tendendo para uma aparência maior e achatada. A linha celular HuH7 é caracterizada por um número cromossómico heterogéneo, variando tipicamente entre 55 e 63, o que reflete a variabilidade genética dentro da população celular. Esta heterogeneidade é uma consequência das pressões seletivas encontradas durante a cultura celular e pode variar em diferentes condições laboratoriais.

Análise comparativa: Linhas celulares HuH7 vs. HuH7.5

A linha celular HuH7.5, um derivado da HuH7, difere principalmente devido a uma mutação missense no gene RIG-I (DDX58), crucial para a resposta antiviral intracelular. Esta mutação aumenta a permissividade das células HuH7.5 para a replicação do RNA genómico e subgenómico do VHC, distinguindo-a da linha celular parental HuH7 em termos da sua utilidade na investigação virológica.

Cultivo de células HuH7: protocolos essenciais para um crescimento ideal

As células HuH7, essenciais para uma miríade de estudos de investigação, requerem condições de cultura precisas para se desenvolverem. Esta secção aprofunda os aspetos fundamentais da cultura de células HuH7, garantindo a manutenção da sua relevância fisiológica nas investigações científicas.

Dinâmica do tempo de duplicação

O tempo de duplicação das células HuH7 é normalmente de 24 horas, embora variações nos meios de cultura celular possam prolongar este período para 36-48 horas, destacando a influência das condições ambientais na proliferação celular.

Características de adesão

As células HuH7 formam predominantemente uma monocamada bidimensional, aderindo às superfícies de placas e frascos de cultura, o que sublinha a sua preferência por um substrato físico estável em detrimento de culturas em suspensão.

Densidade de sementeira ideal

Manter a confluência das células HuH7 na faixa de 30 a 90% é fundamental para evitar um declínio nas taxas de proliferação além de 90% de confluência. A subcultura com Accutase facilita o desprendimento, permitindo a sementeira a densidades adaptadas às necessidades experimentais, variando entre os níveis ótimos (2×10⁴ células/cm²) e de saturação (6×10⁴ células/cm²).

Requisitos nutricionais

O Meio de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM) com elevado teor de glicose e suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) proporciona um ambiente nutricional ideal para as células HuH7. A renovação regular do meio, idealmente 2 a 3 vezes por semana, é crucial para a saúde celular sustentada.

Condições ambientais

Uma incubadora humidificada, regulada para 5% de CO₂ e 37 °C, proporciona condições ideais para a cultura de células HuH7, simulando condições fisiológicas propícias às atividades celulares.

Armazenamento a longo prazo

Para uma conservação prolongada, as células HuH7 devem ser armazenadas na fase de vapor de azoto líquido, salvaguardando a sua viabilidade para investigação futura.

Criopreservação e recuperação

A utilização de uma técnica de congelamento gradual é fundamental para manter a viabilidade celular durante a criopreservação. As células devem ser suspensas num meio de congelamento especificamente concebido, como o CM-1, garantindo uma transição suave para o armazenamento criogénico. Após o descongelamento, é essencial para restabelecer as culturas celulares uma reativação rápida, mas suave, num banho-maria a 37 °C, seguida de centrifugação para descartar o meio de congelamento e ressuspensão num meio de crescimento fresco.

Considerações de biossegurança

Recomenda-se a adesão a um protocolo de Nível de Biossegurança 1 para o manuseamento e propagação da linha celular HuH7, em conformidade com as normas de segurança e éticas em ambientes laboratoriais.

Ao aderir a estas condições de cultura meticulosamente delineadas, os investigadores podem garantir o crescimento robusto e a relevância fisiológica das células HuH7 nas suas explorações científicas, abrindo caminho para descobertas revolucionárias na investigação do hepatoma e do vírus da hepatite C.

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Células HuH7: vantagens e desvantagens

A linha celular HuH7 apresenta simultaneamente vantagens e limitações. Vamos analisar os potenciais prós e contras desta linha celular, pois isso poderá ajudá-lo a decidir se é adequada para as suas experiências.

Vantagens da linha celular HuH7

As células HuH7 possuem muitas características que as tornam atraentes para utilização em investigação.

• Fácil propagação: Ao contrário de outras linhas celulares de hepatoma humano, a linha celular HuH7 pode ser cultivada facilmente sem a adição de soro; no entanto, a CLS recomenda a utilização de RPMI 1640 com 10% de FBS e 2 mM de L-glutamina. As células HuH-7 secretam um fator de crescimento que ajuda as células a crescerem sem soro.
• Flexibilidade de transfecção: A linha celular HuH7 é amplamente utilizada para fins de transfecção devido à sua elevada recetividade ao genoma do VHC. Por conseguinte, estas células são fundamentais para o rastreio e desenvolvimento de medicamentos anti-VHC.
• Alternativa aos hepatócitos humanos: A linha celular HuH7 é um excelente substituto dos hepatócitos humanos. Pode ajudar os investigadores a estudar os transportadores hepáticos de fármacos e a compreender a interação de certos fármacos com as MRP (proteínas associadas à resistência a múltiplos fármacos).
• Desenvolvimento de um modelo de xenoenxerto em ratos: As células HuH7 têm sido utilizadas para produzir um modelo de xenoenxerto em ratos originado a partir de uma linha celular. Este modelo animal pode fornecer informações valiosas aos investigadores sobre inibidores da proteína quinase e terapias anticancerígenas.
• Investigação sobre o cancro: A linha celular HuH7 é uma linha celular de cancro do fígado humano, que ajuda os investigadores a realizar estudos sobre o cancro do fígado.

Limitações da linha celular HuH-7

Existem algumas limitações associadas à cultura da linha celular HuH7.

Contaminação microbiana: A contaminação bacteriana é o problema mais comum na cultura celular. Quando ocorre uma infeção, esta pode ser identificada através da alteração do pH e da turbidez do meio de cultura. Entre as contaminações bacterianas, a contaminação por micoplasma não é normalmente evidente. No entanto, afeta lentamente a morfologia, a expressão genética e outras características da linha celular.

Período de cultura: Embora a linha celular HuH-7 seja imortal, exceder o período de cultura pode afetar gradualmente a saúde das células. Pode afetar a taxa de proliferação e a expressão genética, o que pode reduzir a reprodutibilidade dos resultados. Para a linha celular HuH-7, o número de passagens deve ser mantido abaixo de 20–25.

Aplicações das células HuH-7

Esta linha celular derivada de hepatoma humano oferece muitas aplicações de investigação. Aqui, descrevemos algumas áreas de investigação que utilizam a linha celular HuH7.

1. Resistência aos medicamentos: A HuH7 é uma linha celular de carcinoma hepatocelular (CHC) que pode ser utilizada para estudar a resistência aos medicamentos em potenciais tratamentos do cancro do fígado. Um estudo realizado em 2021 utilizou células HuH7, que foram tornadas experimentalmente resistentes ao sorafenib, para desenvolver terapêuticas novas e eficazes, nomeadamente péptidos de auto-montagem que se acumulam nas mitocôndrias.

2. Perspetivas genéticas e perfil molecular através das células HuH7: As distintas linhas celulares HuH7, incluindo vários derivados e variantes, permitiram uma compreensão mais profunda da expressão genética e do papel de marcadores genómicos específicos na doença. Técnicas como a espectroscopia Raman, defendidas por investigadores como Evgeny Gladilin, têm sido aplicadas às células HuH7 para a caracterização molecular e celular, revelando insights sobre a resposta celular à infeção viral. O potencial da espectroscopia Raman, combinado com métodos como a proteómica quantitativa, facilitou a exploração das respostas das células hospedeiras, incluindo a resposta do interferão e as alterações nas gotículas lipídicas, que são fundamentais para compreender a replicação do VHC e o efeito da SARS. A expressão de diferentes marcadores oncogénicos pode ser investigada para compreender o seu comportamento em resposta a qualquer tratamento, como num estudo que utilizou células HuH7 para investigar o efeito do composto kaempferol no padrão de expressão dos genes da via MMP9 e AKT. Estas vias regulam a metástase e a invasividade do carcinoma hepatocelular. Outro estudo recente também investigou o papel do gene da cascata de sinalização Wnt/β-catenina na sobrevivência e crescimento das células de HCC.

3. Desenvolvimento de medicamentos: as células HuH7 são amplamente utilizadas em estudos de triagem e desenvolvimento de medicamentos contra o cancro do fígado. Foram realizados vários estudos para investigar o potencial inibidor de muitos extratos vegetais, compostos à base de plantas, nanopartículas e outros agentes terapêuticos contra o HCC. Um estudo realizado em 2022 analisou as propriedades pró-apoptóticas e anticancerígenas de um radionuclídeo contra o carcinoma hepatocelular utilizando uma linha celular HuH7.

4. Células HuH7: Um ponto focal na investigação viral e na análise celular As células HuH7 tornaram-se uma pedra angular no estudo da infeção viral e das doenças infecciosas, particularmente do vírus da hepatite C (VHC) e das suas interações com coronavírus como o SARS-CoV-2, responsável pela doença coronavírus 2019 (COVID-19). O desenvolvimento de sistemas experimentais de cultura celular do VHC (HCVcc) utilizando células HuH7 avançou significativamente a nossa capacidade de estudar o complexo processo de replicação do VHC e os fatores do hospedeiro essenciais para a infeção pelo VHC. Isto inclui a análise da eficiência da replicação do ARN do VHC e da produção de viriões infecciosos. As distintas linhas de células HuH7, incluindo variantes senescentes e infetadas, proporcionam um painel diversificado para investigar a multiplicidade de infeções, a propagação viral e os mecanismos de inibição contra vírus como o SARS.

Em resumo, o estudo das células HuH7 abrange um amplo espectro de investigações científicas, desde os mecanismos moleculares subjacentes às infeções virais até às respostas celulares detalhadas provocadas por estes agentes patogénicos. Através da lente da investigação com HuH7, a comunidade científica continua a desvendar a dinâmica complexa das interações hospedeiro-vírus, contribuindo para o avanço das estratégias antivirais e para a nossa compreensão dos determinantes celulares nas doenças virais.

Publicações sobre HuH-7

Existe uma grande quantidade de publicações que utilizam a linha celular HuH7 para diferentes fins. Aqui, mencionamos algumas publicações recentes e significativas.

• Aplicação de péptidos de auto-montagem direcionados para as mitocôndrias como um novo tratamento para células de carcinoma hepatocelular resistentes ao sorafenib.

Este estudo foi publicado na Nature Scientific Reports em 2021. O estudo utilizou células de carcinoma hepatocelular resistentes ao sorafenib induzidas experimentalmente (linha celular HuH7) para investigar os efeitos pró-apoptóticos e antitumorais do Mito-FF (peptídeos de auto-montagem que se acumulam nas mitocôndrias), recentemente desenvolvido.

• O kaempferol inibe a migração celular de células de carcinoma hepatocelular humano através da supressão da MMP-9 e da sinalização Akt

Este artigo foi publicado na revista Environmental Toxicology por Po-Chung Ju e colegas em 2021. Neste estudo, os investigadores exploraram o potencial antimetastático de um composto de origem vegetal, o kaempferol, contra células de carcinoma hepatocelular (HuH7). Além disso, estudaram também as vias de sinalização que regulam a metástase e a invasão das células cancerígenas do fígado.

• A dafnetina inibe a sobrevivência das células de carcinoma hepatocelular através da regulação da via de sinalização Wnt/β-catenina

Este artigo foi publicado na revista Drug Development Research em 2022. Este estudo explica o papel anticancerígeno do composto daphnetina contra o CHC. Este composto de origem vegetal inibe a sinalização Wnt/β-catenina para restringir o crescimento das células cancerígenas.

• O RGFP966 suprime o crescimento e a migração tumoral através da inibição da expressão do EGFR em células de carcinoma hepatocelular in vitro

Este artigo de investigação, publicado na revista Drug Design, Development, and Therapy, descreve o papel da sinalização do EGFR no crescimento e metástase do carcinoma hepatocelular. O estudo utilizou células HuH7 para investigar o efeito inibidor do RGFP966, um inibidor da histona desacetilase 3 (HDAC3), contra o CHC através da supressão dos genes da via do EGFR.

• O perrenato de rênio (188ReO4) induziu a apoptose e reduziu o fenótipo canceroso em células de cancro do fígado

Esta publicação na revista Cells indica a utilização de células HuH7 na investigação do potencial anti-CHC de um radionuclídeo, ou seja, o perrenato de rênio.

• Atividade antiviral de nanopartículas de quitosana encapsulando curcumina contra o vírus da hepatite C genótipo 4a em linhas celulares de hepatoma humano

Este estudo foi publicado no International Journal of Nanomedicine. O estudo utilizou células HuH7 para explorar a atividade antiviral de nanopartículas de quitosana contendo curcumina contra o genótipo 4a do VHC.

Recursos HuH-7: Protocolos, Vídeos e Mais

Existem muitos recursos disponíveis para a cultura e manutenção da linha celular HuH7. Aqui, irá conhecer os recursos disponíveis para explicar os protocolos de cultura celular e transfecção para HuH7, bem como vídeos educativos.

Protocolos de cultura celular

Os recursos a seguir podem ajudá-lo a dar os primeiros passos na cultura e manutenção de HuH7.

• Informações e recursos sobre a cultura celular HuH-7: Este site contém muitas informações úteis, incluindo o protocolo de subcultura da linha celular HuH7, o seu armazenamento e manuseamento.

• Protocolo de cultura celular HuH7

Protocolos de transfecção de HuH7

As células HuH7 são transfectadas de várias formas. Os recursos a seguir fornecem uma grande quantidade de informações sobre protocolos de transfecção, reagentes e produtos químicos necessários, dicas úteis e precauções.

Vídeos relacionados com a linha celular HuH7

Existem muitos vídeos educativos disponíveis sobre protocolos básicos de subcultivo, plaqueamento e transfecção, entre outros.

• Passagem de células: Noções básicas de cultura celular: Este vídeo trata do protocolo básico de cultura para a linha celular.

Esperamos que as informações fornecidas neste artigo o ajudem a adquirir conhecimentos básicos e avançados sobre a linha celular HuH7 antes de trabalhar com ela. Se pretender utilizar estas células no seu trabalho de investigação, pode encomendá-las através de nós.

Perguntas frequentes sobre a linha celular HuH7 e a investigação viral