Células HuH7: Uma porta de entrada para a investigação do hepatoma e do VHC

A linha celular HuH7, derivada do hepatoma humano, representa uma coleção imortalizada de células epiteliais tumorigénicas. Esta linha, juntamente com os seus derivados HuH7.5 e HuH7.5.1, serve como substituto prático dos hepatócitos primários em contextos experimentais. É predominantemente utilizada em modelos de cultura de células para investigar a infeção pelo vírus da hepatite C (VHC) e a fisiopatologia do hepatoma.

Origem e caraterísticas das células HuH7

É essencial compreender as origens, as principais caraterísticas e as condições de cultura ideais da linha celular HuH7 antes da sua aplicação na investigação.

A linha celular HuH7 foi criada por Sato, J, e Nakabayshi, H em 1982, derivada de uma linhagem de cancro de hepatócitos altamente diferenciada. Foi originalmente obtida a partir de um carcinoma hepatocelular de um homem japonês de 57 anos. Caracterizadas pela sua capacidade de produzir várias substâncias fisiologicamente relevantes, como a albumina e a alfa-fetoproteína, as células HuH7 apresentam uma elevada suscetibilidade à infeção pelo VHC, o que as torna adequadas para utilização em sistemas de replicão do VHC. As células HuH7 apresentam uma morfologia semelhante à do epitélio, com uma forma hexagonal, e aderem a superfícies para formar monocamadas 2D durante o crescimento. em média, as células HuH7 têm um diâmetro de 21,9 µm, tendendo para uma aparência maior e achatada. A linha celular HuH7 é caracterizada por um número cromossómico heterogéneo, variando tipicamente entre 55 e 63, o que reflecte a variabilidade genética dentro da população celular. Esta heterogeneidade é uma consequência das pressões selectivas encontradas durante a cultura de células e pode variar em diferentes condições laboratoriais.

Análise comparativa: Linhas celulares HuH7 vs. HuH7.5

A linha celular HuH7.5, um derivado da HuH7, difere principalmente devido a uma mutação missense no gene RIG-I (DDX58), crucial para a resposta antiviral intracelular. Esta mutação aumenta a permissividade das células HuH7.5 para a replicação do ARN genómico e subgenómico do VHC, distinguindo-a da linha celular original HuH7 em termos da sua utilidade na investigação virológica.

Cultivo de células HuH7: Protocolos essenciais para um crescimento ótimo

As células HuH7, parte integrante de uma miríade de estudos de investigação, necessitam de condições de cultura precisas para se desenvolverem. Esta secção aborda os aspectos fundamentais da cultura de células HuH7, garantindo a manutenção da sua relevância fisiológica em investigações científicas.

Dinâmica do tempo de duplicação

O tempo de duplicação das células HuH7 é tipicamente de 24 horas, embora variações nos meios de cultura de células possam alargar este período para 36-48 horas, realçando a influência das condições ambientais na proliferação celular.

Caraterísticas de adesão

As células HuH7 formam predominantemente uma monocamada bidimensional, aderindo às superfícies de placas e frascos de cultura, sublinhando a sua preferência por um substrato físico estável em vez de culturas em suspensão.

Densidade óptima de sementeira

A manutenção da confluência das células HuH7 no intervalo de 30-90% é fundamental para evitar um declínio nas taxas de proliferação para além de 90% de confluência. A subcultura com accutase facilita o descolamento, permitindo a sementeira em densidades adaptadas às necessidades experimentais, variando entre níveis óptimos (2×10⁴ células/cm²) e níveis de saturação (6×10⁴ células/cm²).

Requisitos nutricionais

O Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose e suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) proporciona um ambiente nutricional ideal para as células HuH7. A renovação regular do meio, idealmente 2-3 vezes por semana, é crucial para a saúde sustentada das células.

Condições ambientais

Uma incubadora humidificada regulada para 5% de CO₂ e 37°C suporta de forma óptima a cultura de células HuH7, simulando condições fisiológicas propícias às actividades celulares.

Armazenamento a longo prazo

Para uma preservação prolongada, as células HuH7 devem ser armazenadas na fase de vapor do azoto líquido, salvaguardando a sua viabilidade para investigação futura.

Criopreservação e recuperação

A utilização de uma técnica de congelação gradual é fundamental para manter a viabilidade das células durante a criopreservação. As células devem ser suspensas num meio de congelação especificamente concebido, como o CM-1, assegurando uma transição suave para o armazenamento criogénico. Após a descongelação, é essencial um reavivamento rápido mas suave num banho de água a 37°C, seguido de centrifugação para eliminar o meio de congelação e ressuspensão em meio de crescimento fresco, para restabelecer as culturas de células.

Considerações de biossegurança

A adesão a um protocolo de Nível de Biossegurança 1 é aconselhada para o manuseamento e propagação da linha celular HuH7, em conformidade com as normas de segurança e ética em ambientes laboratoriais.

Ao aderir a estas condições de cultura meticulosamente delineadas, os investigadores podem garantir o crescimento robusto e a relevância fisiológica das células HuH7 nas suas explorações científicas, abrindo caminho para descobertas inovadoras na investigação do hepatoma e do vírus da hepatite C.

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Células HuH7: Vantagens e Desvantagens

A linha celular HuH7 oferece vantagens e limitações ao mesmo tempo. Vamos analisar os potenciais prós e contras desta linha celular, uma vez que isso pode ajudá-lo a decidir se é adequada para as suas experiências.

Vantagens da linha celular HuH7

As células HuH7 possuem muitas caraterísticas que as tornam atractivas para utilização em investigação.

• Fácil propagação: Ao contrário de outras linhas celulares de hepatoma humano, a linha celular HuH7 pode ser facilmente cultivada sem a adição de soro; no entanto, a CLS recomenda a utilização de RPMI 1640 com 10% de FBS e 2 mM de L-glutamina. As células HuH-7 segregam um fator de crescimento que ajuda as células a crescer sem soro.
• Flexibilidade de transfecção: A linha celularHuH7 é amplamente utilizada para fins de transfecção devido à sua elevada recetividade ao genoma do VHC. Por conseguinte, estas células são essenciais para o rastreio e o desenvolvimento de medicamentos anti-HCV.
• Alternativa aos hepatócitos humanos: A linha celular HuH7 é um excelente substituto dos hepatócitos humanos. Pode ajudar os investigadores a estudar os transportadores hepáticos de fármacos e a compreender a interação de certos fármacos com MRPs (proteínas associadas à resistência a múltiplos fármacos).
• Desenvolvimento de um modelo de ratinho xenoenxertado: As células HuH7 foram utilizadas para produzir um modelo de ratinho xenoenxertado originário de uma linha celular. Este modelo animal pode fornecer informações valiosas aos investigadores sobre os inibidores da proteína quinase e as terapias anti-cancro.
• Investigação do cancro: A linha celular HuH7 é uma linha celular de cancro do fígado humano, que ajuda os investigadores a realizar estudos sobre o cancro do fígado.

Limitações da linha celular HuH-7

Existem algumas limitações associadas à cultura da linha celular HuH7.

Contaminação microbiana: A contaminação bacteriana é o problema mais comum na cultura de células. Quando ocorre uma infeção, esta pode ser distinguida através da alteração do pH e da turvação do meio de cultura. Entre a contaminação bacteriana, a contaminação por micoplasma não é normalmente aparente. No entanto, afecta lentamente a morfologia, a expressão genética e outras caraterísticas da linha celular.

Período de cultura: Embora a linha celular HuH7 seja imortal, exceder o período de cultura pode afetar gradualmente a saúde das células. Pode afetar a taxa de proliferação e a expressão genética, o que pode reduzir a reprodutibilidade dos resultados. No caso da linha celular HuH7, o número de passagens deve ser inferior a 20-25.

Aplicações das células HuH-7

Esta linha celular derivada do hepatoma humano oferece muitas aplicações de investigação. Descrevemos aqui algumas áreas de investigação que utilizam a linha celular HuH7.

1. Resistência aos medicamentos: A HuH7 é uma linha celular de carcinoma hepatocelular (CHC) que pode ser utilizada para estudar a resistência aos medicamentos contra potenciais tratamentos do cancro do fígado. Um estudo realizado em 2021 utilizou células HuH7, que foram experimentalmente tornadas resistentes ao sorafenib, para desenvolver terapêuticas novas e eficazes, ou seja, péptidos de auto-montagem que acumulam mitocôndrias.

2. Percepções genéticas e perfis moleculares através das células HuH7: As diferentes linhas celulares HuH7, incluindo vários derivados e variantes, permitiram uma compreensão mais profunda da expressão genética e do papel de marcadores genómicos específicos na doença. Técnicas como a espetroscopia Raman, defendida por investigadores como Evgeny Gladilin, foram aplicadas às células HuH7 para a caraterização molecular e celular, revelando conhecimentos sobre a resposta celular à infeção viral. O potencial da espetroscopia Raman, combinado com métodos como a proteómica quantitativa, facilitou a exploração das respostas das células hospedeiras, incluindo a resposta do interferão e as alterações nas gotículas lipídicas, que são fundamentais para compreender a replicação do VHC e o efeito da SRA. A expressão de diferentes marcadores oncogénicos pode ser investigada para compreender o seu comportamento em resposta a qualquer tratamento, como num estudo que utilizou células HuH7 para investigar o efeito do composto Kaempferol no padrão de expressão dos genes da via MMP9 e AKT. Estas vias regulam a metástase e a invasividade do carcinoma hepatocelular. Outro estudo recente também investigou o papel do gene da cascata de sinalização Wnt/β-catenina na sobrevivência e crescimento das células HCC.

3. Desenvolvimento de medicamentos: As células HuH7 são amplamente utilizadas em estudos de rastreio e desenvolvimento de medicamentos contra o cancro do fígado. Vários estudos foram realizados para investigar o potencial inibitório de muitos extratos de plantas, compostos à base de plantas, nanopartículas e outros agentes terapêuticos contra o CHC. Um estudo realizado em 2022 estudou as propriedades pró-apoptóticas e anti-cancerígenas de um radionuclídeo contra o carcinoma hepatocelular utilizando uma linha celular HuH7.

4. Células HuH7: Um ponto fulcral na investigação viral e na análise celular As células HuH7 tornaram-se uma pedra angular no estudo da infeção viral e das doenças infecciosas, em especial do vírus da hepatite C (VHC) e das suas interações com os coronavírus, como o SARS-CoV-2, responsável pela doença do coronavírus 2019 (COVID-19). O desenvolvimento de sistemas experimentais de cultura de células de HCV (HCVcc) utilizando células HuH7 fez avançar significativamente a nossa capacidade de estudar o intrincado processo de replicação do HCV e os factores do hospedeiro essenciais para a infeção pelo HCV. Isto inclui a análise da eficiência da replicação do ARN do VHC e a produção de viriões infecciosos. As diferentes linhas de células HuH7, incluindo variantes senescentes e infectadas, fornecem um painel diversificado para investigar a multiplicidade da infeção, a propagação viral e os mecanismos de inibição contra vírus como o SARS.

Em suma, o estudo das células HuH7 abrange um vasto espetro de investigações científicas, desde os mecanismos moleculares subjacentes às infecções virais até às respostas celulares detalhadas provocadas por estes agentes patogénicos. Através da investigação das células HuH7, a comunidade científica continua a descobrir a dinâmica complexa das interações vírus-hospedeiro, contribuindo para o avanço das estratégias antivirais e para a nossa compreensão dos determinantes celulares das doenças virais.

Publicações HuH-7

Existe uma grande quantidade de publicações que utilizam a linha celular HuH7 para diferentes objectivos. Aqui, mencionamos algumas publicações recentes e significativas.

• Aplicação de péptidos de auto-montagem direcionados para a mitocôndria como um novo tratamento para células de carcinoma hepatocelular resistentes ao sorafenib.

Este estudo foi publicado na revista Nature Scientific Reports em 2021. O estudo utilizou células de carcinoma hepatocelular resistentes ao sorafenib induzidas experimentalmente (linha celular HuH7) para investigar os efeitos pró-apoptóticos e antitumorais de Mito-FF (péptidos de auto-montagem que acumulam mitocôndrias) recentemente desenvolvidos.

• O Kaempferol inibe a migração celular das células do carcinoma hepatocelular humano através da supressão da sinalização da MMP-9 e da Akt

Este artigo foi publicado na revista Environmental Toxicology por Po-Chung Ju e colegas em 2021. Neste estudo, os pesquisadores exploraram o potencial antimetastático de um composto à base de plantas, o kaempferol, contra células de carcinoma hepatocelular (HuH7). Além disso, eles também estudaram as vias de sinalização que regulam a metástase e a invasão de células de câncer de fígado.

• A dafnetina inibe a sobrevivência das células do carcinoma hepatocelular através da regulação da via de sinalização Wnt/β-catenina

Este artigo foi publicado na revista Drug Development Research em 2022. Este estudo explica o papel anticancerígeno do composto daphnetin contra o HCC. Este composto derivado de planta inibe a sinalização Wnt / β-catenina para restringir o crescimento da célula cancerosa.

• RGFP966 suprime o crescimento e a migração do tumor através da inibição da expressão de EGFR em células de carcinoma hepatocelular in vitro

Este trabalho de investigação, publicado na revista Drug Design, Development, and Therapy, descreve o papel da sinalização EGFR no crescimento e metástase do carcinoma hepatocelular. O estudo utilizou células HuH7 para investigar o efeito inibitório do RGFP966, um inibidor da histona desacetilase 3 (HDAC3), contra o CHC através da supressão dos genes da via do EGFR.

• O perrenato de rénio (188ReO4) induziu a apoptose e reduziu o fenótipo canceroso em células de cancro do fígado

Esta publicação na revista Cells indica a utilização de células HuH7 na investigação do potencial anti-HCC de um radionuclídeo, ou seja, o perrenato de rénio.

• Atividade antiviral de nanopartículas de quitosano que encapsulam curcumina contra o genótipo 4a do vírus da hepatite C em linhas celulares de hepatoma humano

Este estudo foi publicado no International Journal of Nanomedicine. O estudo utilizou células HuH7 para explorar a atividade antiviral de nanopartículas de quitosano contendo curcumina contra o genótipo 4a do HCV.

Recursos HuH-7: Protocolos, vídeos e mais

Existem muitos recursos disponíveis para a cultura e manutenção da linha de células HuH7. Aqui, ficará a conhecer os recursos disponíveis para explicar os protocolos de cultura e transfecção de células HuH7 e os vídeos educativos.

Protocolos de cultura de células

Os seguintes recursos podem ajudá-lo a iniciar a cultura e manutenção da linha celular HuH7.

• Informações e recursos sobre a cultura de células HuH-7: Este sítio Web contém muitas informações úteis, incluindo o protocolo de subcultura da linha de células HuH7, o seu armazenamento e o seu manuseamento.

• Protocolo de cultura de células HuH7

Protocolos de transfecção de HuH7

As células HuH7 são transfectadas de várias formas. Os seguintes recursos fornecem uma grande quantidade de informações sobre protocolos de transfecção, reagentes e produtos químicos necessários, dicas úteis e precauções.

Vídeos relacionados com a linha celular HuH7

Existem muitos vídeos educativos disponíveis sobre protocolos básicos de subcultura, plaqueamento e transfecção, entre outros.

• Passagem de células: Noçõesbásicas de cultura de células: Este vídeo é sobre o protocolo básico de cultura para a linha de células.

Esperamos que a informação fornecida neste artigo o ajude a adquirir conhecimentos básicos e avançados sobre a linha celular HuH7 antes de trabalhar com ela. Se quiser utilizar estas células no seu trabalho de investigação, pode encomendar-nos.

Perguntas frequentes sobre a linha celular HuH7 e a investigação viral