Células HaCaT - Explorando a biologia e a doença da pele
As células HaCaT são derivadas de queratinócitos epidérmicos humanos e são normalmente utilizadas para explorar a homeostasia epidérmica e as patologias associadas. Estas células são consideradas queratinócitos humanos espontaneamente imortalizados, o que é digno de nota pelo facto de terem sido derivadas de queratinócitos cutâneos normais sem sofrerem crises ou atrasos de crescimento. Esta origem única confere às células HaCaT um conjunto de propriedades genéticas e de crescimento que as diferem de outras linhas celulares. Apesar de exibir um fenótipo transformado in vitro com propriedades clonogénicas em ágar ou plástico, a linha celular HaCaT permanece não-tumorigénica. Sendo a primeira linha de células epiteliais estáveis da pele humana adulta que apresenta uma diferenciação normal, as células HaCaT são uma ferramenta valiosa para investigar a regulação da queratinização nas células humanas. Estas células têm uma vasta gama de aplicações devido à sua capacidade de proliferação e diferenciação efectiva in vitro.
- Caraterísticas das células HaCaT
- Caraterísticas Genéticas e Origem das Células HaCaT
- Como colher células HaCaT em 5 passos simples
- Aplicações das células HaCaT
- Vídeos em destaque: Explorando o mundo das células HaCaT
1.caraterísticas das células HaCaT
As células HaCaT podem ser cultivadas sob condições de baixo teor de cálcio e têm uma aparência fusiforme que carece de junções apertadas célula-a-célula, tal como as células primárias mantidas sob as mesmas condições. Na epiderme normal, os queratinócitos desenvolvem-se a partir de células estaminais na camada basal e progridem através das camadas espinhosa e granular antes de atingirem a camada córnea e se descamarem para o ambiente. Este equilíbrio fortemente regulado entre a proliferação e a descamação resulta numa renovação ou mudança completa a cada 28 dias, um processo complexo conhecido como queratinização. Este processo é altamente regulado e envolve alterações marcantes na expressão genética, no desenho estrutural e na atividade enzimática. Para a análise in vitro e in vivo, as células HaCaT devem manter as queratinas epidérmicas caraterísticas das camadas diferenciadas de células da epiderme humana, que são essenciais para manter a integridade estrutural e a resiliência da pele. Embora possam ocorrer alterações cromossómicas sequenciais nas células HaCaT, estas podem não estar associadas a problemas de diferenciação significativos e, em vez disso, demonstram a transformação espontânea de queratinócitos humanos adultos in vitro.
2.caraterísticas genéticas e origem das células HaCaT
As células HaCaT são uma linha celular de queratinócitos humanos espontaneamente imortalizada, originária da pele adulta e que representa um percurso evolutivo único. Estas células possuem mutações em ambos os alelos do gene p53, o que é típico das mutações induzidas pela radiação UV [3,4]. Além disso, presume-se que as células HaCaT tenham sido geradas por mutações no gene supressor de tumor p53, seguidas pela perda de genes de senescência [5].
O gene supressor de tumor p53, conhecido pelo seu papel na reparação do ADN e como guardião do genoma, induz a resposta da pele humana a danos no ADN [4]. Foi observado que as células HaCaT perderam parcialmente o seu mecanismo de proteção contra danos no ADN devido à mutação in vivo do gene p53, tornando-as susceptíveis de acumular alterações citogenéticas em resposta a temperaturas de cultura elevadas. Outro mecanismo de imortalização das células HaCaT envolve o aumento da atividade da enzima telomerase [7]. Nas células normais, os telómeros encurtam continuamente com cada divisão celular até se atingir a senescência celular. A telomerase é um complexo enzimático celular especializado com atividade de transcriptase reversa que mantém o comprimento estável dos telómeros. Em contraste, as células HaCaT mostram uma atividade telomerase significativamente aumentada, resultando num comprimento de telómeros bem mantido. Estas observações confirmam o papel da telomerase no processo de imortalização das células HaCaT.
Foram identificadas três translocações cromossómicas específicas que resultam na perda de uma cópia dos braços cromossómicos 3p, 4p e 9p, num ganho de 9q e na formação de isocromossomas. A perda do braço curto do cromossoma 3p pode levar à perda de genes de senescência e à imortalização das células HaCaT [8]. As células HaCaT são hipodiplóides e possuem cromossomas marcadores distintos e estáveis que representam a sua origem monoclonal. As caraterísticas e a cabeça da linha de células HaCaT foram confirmadas utilizando a impressão digital do ADN com marcadores minissatélites hipervariáveis [3-6].
3.como colher células HaCaT em 5 passos simples
- Remover o meio de cultura e enxaguar as células aderentes utilizando 3-5 mL de PBS sem cálcio e magnésio para frascos T25 ou 5-10 mL para frascos T75.
- Adicionar 1-2 mL de solução de EDTA a 0,05% recentemente preparada por cada frasco T25 ou 2,5 mL por cada frasco T75, assegurando que toda a camada de células é coberta, e incubar a 37°C durante 10 minutos.
- Adicionar 1 ml de solução de tripsina/EDTA (0,05%/0,025%) recém-preparada por frasco T25, ou 2,5 ml por frasco T75, assegurando novamente a cobertura completa da folha de células. As células devem desprender-se no espaço de 1-2 minutos.
- Parar a atividade da tripsina adicionando um meio de cultura de células contendo FBS.
- Dispensar as células em novos frascos contendo meio de cultura de células fresco.
4. Aplicações das células HaCaT
As células HaCaT são uma ferramenta valiosa para o estudo dos queratinócitos [9]. Estas células imortais funcionam como células pré-neoplásicas e podem fornecer informações sobre as alterações envolvidas na transformação maligna e neoplásica [10]. As culturas de células HaCaT em monocamada são essenciais para aplicações de análise da toxicidade celular e da cicatrização de feridas in vitro. As células HaCaT também podem ser utilizadas para avaliar a toxicidade cutânea causada por vários agentes e processos neoplásicos ou inflamatórios. Podem ser utilizadas para analisar os diferentes mecanismos das reacções alérgicas cutâneas, os efeitos das espécies reactivas de oxigénio e a irradiação por UV. Após estimulação, as células HaCaT podem diferenciar-se e expressar marcadores de diferenciação específicos, como a involucrina, K14 e K10. As células HaCaT são também habitualmente utilizadas como modelo para estudar a fisiopatologia da homeostase epidérmica [6].
As células HaCaT mantêm a sua capacidade de reconstituir uma epiderme estruturada in vivo após o transplante, resultando numa estrutura epidérmica estratificada que pode ser revertida entre um estado basal e diferenciado através de alterações na concentração de cálcio no meio. Estas células também permitem a caraterização de vários processos biológicos, tais como a sua utilização como um sistema modelo de vitamina D e o metabolismo na pele. Como as células HaCaT não são geneticamente modificadas, apresentam uma visão imparcial do amplo espetro de eventos genéticos iniciais na pele humana.
5. Vídeos em destaque: Explorando o mundo das células HaCaT
"Migração de células HaCaT": Este vídeo mostra o processo de migração celular nas células HaCaT. A migração das células é um processo essencial para vários processos biológicos, como a cicatrização de feridas e a metástase do cancro. O vídeo demonstra o movimento das células HaCaT sob um microscópio, fornecendo uma representação visual de como estas células migram. A atividade das células é observada à medida que se deslocam de um local para outro, e o vídeo fornece uma ilustração clara das alterações que ocorrem nas células durante este processo.
"Ensaio de raspagem efectuado em células HaCaT": Este vídeo mostra um ensaio de raspagem efectuado em células HaCaT. O ensaio Scratch é uma técnica muito utilizada para estudar a migração celular e, neste caso, é utilizada para analisar a migração das células HaCaT. O vídeo demonstra o processo de criação de um risco na superfície de uma placa de cultura de células, que é depois observado ao microscópio à medida que as células HaCaT migram e fecham a lacuna ao longo do tempo.
"Crescimento celular de queratinócitos HaCaT para experiências de cicatrização de feridas": Este vídeo demonstra o processo de crescimento celular de queratinócitos HaCaT para experiências de cicatrização de feridas. Os queratinócitos HaCaT são uma linha celular comummente utilizada em estudos de cicatrização de feridas.
"Diferenciação de células HaCaT": Este vídeo apresenta os passos necessários para diferenciar as células HaCaT. As células HaCaT podem diferenciar-se em diferentes tipos de células da pele. O vídeo demonstra as alterações nas células HaCaT à medida que se diferenciam, representando visualmente os vários marcadores e caraterísticas da diferenciação. O processo de diferenciação é fundamental para o funcionamento normal da pele, e o vídeo destaca as diferentes fases de diferenciação a que as células HaCaT são submetidas.
Referências
- Angel P e Karin M: The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell proliferation and transformation (O papel de Jun, Fos e do complexo AP-1 na proliferação e transformação celular). Biochim Biophys Ata 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolamento e caraterização de uma linha de queratinócitos humanos (NM-1) de vida longa e espontânea. In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: mutações p53 em linhas de células epiteliais humanas imortalizadas. Carcinogénese 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes (MOL CARCINOG. 1998;23(3):144-158).
- Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. As células HaCaT são um modelo fiável de diferenciação in vitro para dissecar a resposta inflamatória/reparadora dos queratinócitos humanos. Mediadores Inflamm. 2017;2017:7435621.
- Boukamp, P. et al. Queratinização normal numa linha celular de queratinócitos humanos aneuplóides espontaneamente imortalizados. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
- Gibbs, Graham: Analysing qualitative data. The Sage qualitative research kit. Londres: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Applied research design: a practical guide. Sage: London
- Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Cell Biol.(1988);106:761-771.