Kaip gaminti lentivirusinius vektorius naudojant HEK293T ląsteles
Lentivirusiniai vektoriai tapo svarbiais šiuolaikinės molekulinės biologijos, genų terapijos ir ląstelių inžinerijos įrankiais. "Cytion" optimizavo aukšto titro lentivirusinių vektorių gamybos protokolus, naudodami aukščiausios kokybės HEK293T ląsteles, kurios yra specialiai sukurtos veiksmingai transfekcijai ir virusų gamybai. Šiame išsamiame vadove pateikiamas mūsų patikrintas aukštos kokybės lentivirožių vektorių gamybos protokolas, skirtas jūsų mokslinių tyrimų poreikiams.
| Parametrai | Rekomendacija |
|---|---|
| Optimali ląstelių linija | HEK293T ląstelės (geriausiems rezultatams pasiekti naudokite 5-20 eigą) |
| Ląstelių susiliejimas transfekcijos metu | 70-80% |
| Transfekcijos metodas | Kalcio fosfato arba PEI pagrindu atliekama transfekcija |
| Vektorių surinkimo laikas | Pirmasis surinkimas: 48 val. po transfekcijos Antrasis surinkimas: 72 val. po transfekcijos |
| Numatomas titrų intervalas | 106-108 TU/ml (nekoncentruotas) |
Įvadas į lentivirinius vektorius ir HEK293T ląsteles
Iš ŽIV-1 gauti lentivirusiniai vektoriai turi keletą privalumų genų perdavimui, įskaitant gebėjimą integruotis tiek į besidalijančias, tiek į nesidalijančias ląsteles, ilgalaikę stabilią raišką ir santykinai didelę pakuotės talpą. Šių vektorių gamybai labai svarbios HEK293T ląstelės, kuriose ekspresuojamas SV40 didysis T antigenas, leidžiantis epizominį plazmidžių, turinčių SV40 replikacijos pradą, replikavimą. Optimaliai virusų gamybai rekomenduojame naudoti HEK293T ląsteles nuo 5 iki 20 stadijos, nes ląstelės, esančios už šio intervalo ribų, gali pasižymėti mažesniu transfekcijos efektyvumu ir mažesne virusų išeiga.
Ląstelių susiliejimas: Lemiamas sėkmingo transfekcijos veiksnys
Sėkmingai lentivirusų gamybai labai svarbu pasiekti tinkamą ląstelių tankį transfekcijos metu. Nuolat nustatome, kad HEK293T ląstelės transfekcijos metu turėtų būti 70-80 % susiliejimo. Tokio tankio ląstelės yra logaritminėje augimo fazėje, o tai optimizuoja transfekcijos efektyvumą ir vėlesnę virusų gamybą. Dėl mažesnio susilpnėjimo gali būti gaunamas neoptimalus derlius, o dėl pernelyg susilpnėjusių kultūrų dažnai pablogėja ląstelių sveikata, sumažėja transfekcijos efektyvumas ir virusų titrai. Standartinėje 10 cm lėkštelėje rekomenduojame sėti 5-6 × 10⁶ ląstelių likus 24 valandoms iki transfekcijos, kad būtų pasiektas optimalus tankis.
Tinkamo transfekcijos metodo pasirinkimas
Lentivirusų plazmidėms įterpti į HEK293T ląsteles rekomenduojame kalcio fosfato nusodinimo arba polietilenimino (PEI) transfekcijos metodus. Abu metodai mūsų laboratorijose pasirodė esantys labai veiksmingi: kalcio fosfatas yra tradicinis pasirinkimas, o PEI yra ekonomiškesnė alternatyva, nesumažinanti efektyvumo. Kalcio fosfato metodas išsiskiria švelniu poveikiu ląstelių gyvybingumui, o su PEI paprastai pasiekiamas šiek tiek didesnis transfekcijos greitis. Pirmą kartą naudojantiems šį metodą siūlome pradėti nuo PEI metodo, kai DNR ir PEI santykis yra 1:3, nes šis metodas yra atlaidesnis technikos pokyčiams, o virusų išeiga išlieka puiki.
Optimalus vektorių rinkimo laikas
Lentivirinių vektorių rinkimo laikas turi didelę įtaką išeigai ir kokybei. Mūsų išsamūs bandymai su HEK293T ląstelėmis rodo, kad dvigubo rinkimo metodas maksimaliai padidina virusų gamybą. Rekomenduojame pirmą kartą rinkti praėjus 48 valandoms po transfekcijos, kai virusų gamyba pasiekia reikšmingą lygį, bet prieš tai, kai ląstelės žūsta. Kruopščiai surinkus ir pakeitus terpę, antrasis derlius surenkamas praėjus 72 valandoms po transfekcijos, kad būtų užfiksuotos per šį laikotarpį susidariusios papildomos viruso dalelės. Tokia nuoseklaus surinkimo strategija paprastai padidina bendrą išeigą 30-50 %, palyginti su vienkartiniu surinkimu, tačiau nepakenkia vektoriaus kokybei. Laiko požiūriu skubiems taikymams vien tik 48 valandų surinkimas paprastai užtikrina pakankamą titrą, kurio pakanka daugumai eksperimentinių poreikių.
Tikėtinas titravimo intervalas ir išeigos optimizavimas
Pagal mūsų optimizuotą protokolą nekoncentruotų lentivirusų preparatų titrai paprastai svyruoja nuo106 iki108 transdukuojančių vienetų mililitre (TU/ml), priklausomai nuo konkretaus perkėlimo vektoriaus ir tikslinės ląstelės tipo. Jei reikia didesnės koncentracijos, ultracentrifuguojant arba nusodinant PEG, titrus galima padidinti 100-1000 kartų. Siekiant padidinti išeigą, rekomenduojame po transfekcijos papildyti mitybinę terpę natrio butiratu (10 mM), kuris gali padidinti viruso gamybą slopindamas histonų deacetilazes ir skatindamas viruso promotorių transkripciją. Be to, inkubacijos temperatūros sumažinimas iki 32-34 °C surinkimo fazės metu gali dar labiau padidinti išeigą, nes sulėtėja viruso skilimas, o gamyba išlieka. Atlikus šiuos optimizavimo veiksmus, mūsų HEK293T ląstelėse nuolat gaunami aukštos kokybės virusų preparatai, tinkami net ir reikliausioms programoms.