Kaip gaminti lentivirusinius vektorius naudojant HEK293T ląsteles

Dėl gebėjimo efektyviai pernešti tiek besidalijančias, tiek nesidalijančias ląsteles lentivirusiniai vektoriai tapo svarbiais genų terapijos, vakcinų kūrimo ir fundamentinių tyrimų įrankiais. "Cytion" optimizavo lentivirusinių vektorių gamybos protokolus, kuriuose naudojamos mūsų HEK293T ląstelės, pasižyminčios puikiu transfekcijos efektyvumu ir dideliu virusų titru. Šiame išsamiame vadove žingsnis po žingsnio aprašomas lentivirožių vektorių gamybos procesas, dažniausiai pasitaikančių problemų šalinimas ir kokybės kontrolės priemonės, užtikrinančios nuoseklius rezultatus.

HEK293T ląstelių svarba gaminant lentivirusus

Sėkmingos lentivirinių vektorių gamybos pagrindas yra optimalios ląstelių linijos pasirinkimas. HEK293T ląstelės yra auksinis šios srities standartas dėl išskirtinio transfekcijos efektyvumo, tvirtų augimo savybių ir gebėjimo gaminti didelius virusų titrus. Šios ląstelės gaunamos iš žmogaus embrioninių inkstų ląstelių, kurios buvo transformuotos 5 tipo adenoviruso DNR ir, kas labai svarbu, išreiškia SV40 didįjį T antigeną. Ši genetinė modifikacija leidžia epizomiškai replikuoti plazmidėms, kuriose yra SV40 replikacijos pradžia, todėl sustiprėja baltymų raiška. "Cytion" mūsų HEK293T ląstelės yra griežtai tikrinamos dėl mikoplazmos, jų autentiškumas nustatomas pagal STR profilį ir joms taikoma išsami kokybės kontrolė, kad būtų užtikrinta nuosekli virusų gamyba visose partijose.

Kultūros terpės optimizavimas siekiant didžiausio virusų kiekio

Idealios HEK293T ląstelių auginimo terpės sukūrimas yra labai svarbus norint gauti didelio titro lentivirusų preparatus. Rekomenduojame naudoti DMEM su 4,5 g/l gliukozės, papildytą 10 % galvijų fetalinio serumo (FBS), 2 mM L-glutaminu ir 1 % nepagrindinių aminorūgščių. Šis praturtintas preparatas suteikia svarbiausių maistinių medžiagų ir augimo veiksnių, kurie palaiko greitą ląstelių dauginimąsi ir didina baltymų sintezės galimybes. Kad rezultatai būtų optimalūs, iki 24 val. iki transfekcijos ląstelės turi būti laikomos aplinkoje be antibiotikų, nes antibiotikai gali trikdyti transfekcijos efektyvumą. Ląstelių tankis yra labai svarbus virusų gamybai - transfekcijos metu siekiama, kad ląstelių susiliejimas būtų 70-80 %, nes per daug susiliejusios kultūros gali sumažinti išeigą, o retos kultūros gali neužtikrinti pakankamo baltymų sintezės pajėgumo. Gamybos sistemoms, kuriose nėra serumo, siūlome naudoti mūsų IMDM terpę, specialiai sukurtą didelio tankio HEK293T kultūroms palaikyti, kartu išlaikant aukštą transfekcijos efektyvumą.

Optimalaus transfekcijos metodo parinkimas virusinių vektorių gamybai

Transfekcijos metodas turi didelę įtaką lentivirožių vektorių gamybos efektyvumui ir atkuriamumui. Kalcio fosfato nusodinimas tebėra ekonomiškai efektyviausias didelio masto gamybos metodas, kuris, kruopščiai laikantis protokolų, duoda puikių rezultatų. Šis metodas pagrįstas kalcio fosfato ir DNR nuosėdų, kurias ląstelės lengvai endocituoja, susidarymu. Norint kasdien gauti pastovius rezultatus, polietilenimino (PEI) transfekcija užtikrina puikų atkuriamumą ir minimalų optimizavimą. PEI su DNR sudaro teigiamai įkrautus kompleksus, kurie sąveikauja su neigiamai įkrautomis ląstelių membranomis ir palengvina efektyvų patekimą į ląsteles. "Cytion" pastebėjome, kad šviežiai paruošti transfekcijos reagentai gerokai padidina efektyvumą - ypač kalcio fosfato metodų atveju. Laboratorijoms, pradedančioms gaminti lentivirusus, rekomenduojame pradėti nuo mūsų optimizuoto PEI protokolo, naudojant HEK293T ląsteles, kurių stadijos yra 5-15. Didindami gamybos mastą, apsvarstykite galimybę pereiti prie suspensijos kultūrų, naudojant mūsų HEK293 suspensijai pritaikytas ląsteles, kurios gali gerokai padidinti išeigą, kartu sumažindamos tvarkymo laiką ir eksploatacinių medžiagų sąnaudas. Nepriklausomai nuo pasirinkto metodo, norint gauti pastovius ir didelio efektyvumo rezultatus, transfekcijos mišinio ruošimo metu būtina išlaikyti tikslų pH (7,05-7,15).

Transfekcijos efektyvumo stebėjimas ir didinimas

Sėkmingai lentivirinių vektorių gamybai svarbiausia pasiekti aukštą transfekcijos efektyvumą, o optimaliems rezultatams pasiekti paprastai reikia didesnio nei 80 % transfekcijos efektyvumo. Įterpus GFP reporterio plazmidę (5-10 % visos DNR), galima nesudėtingai vizualiai įvertinti transfekcijos sėkmę naudojant fluorescencinę mikroskopiją. Šis vizualinis rodiklis labai koreliuoja su galutine virusų išeiga ir yra ankstyvas kokybės kontrolės taškas jūsų gamybos linijoje. Kiekybiniam įvertinimui galima naudoti srauto citometriją, kuri leidžia tiksliai išmatuoti GFP teigiamų ląstelių procentinę dalį praėjus 24-48 valandoms po transfekcijos. Transfekcijos efektyvumui didelę įtaką daro keli veiksniai: ląstelių sveikata (naudokite HEK293T ląsteles, kurių gyvybingumas >95 %), DNR kokybė (naudokite preparatus be endotoksinų), ląstelių tankis (70-80 % susiliejimas) ir terpės sąlygos (transfekciją atlikite šviežioje terpėje be antibiotikų). Jei efektyvumas nuolat mažėja žemiau 70 %, rekomenduojame spręsti problemas optimizuojant DNR ir transfekcijos reagento santykį, tikrinant terpės pH stabilumą arba svarstant galimybę pereiti prie mūsų HEK293A ląstelių, kurios kai kuriose laboratorijose yra tinkamesnės konkretiems transfekcijos protokolams. Atminkite, kad transfekcijos efektyvumas tiesiogiai susijęs su viruso titru - kas 10 % pagerinus transfekciją, paprastai atitinkamai padidėja viruso gamyba.

Strateginis virusų rinkimo ir surinkimo laikas

Lentivirinių vektorių derliaus nuėmimo laikotarpis - tai kritinė pusiausvyra tarp didžiausio derliaus ir vektoriaus stabilumo. Mūsų išsamūs bandymai su HEK293T ląstelėmis rodo, kad didžiausia virusų gamyba paprastai pasiekiama praėjus 48-72 valandoms po transfekcijos, o didžiausi titrai dažnai stebimi praėjus 60 valandų. Per šį optimalų derliaus nuėmimo laikotarpį viruso dalelės nuolat išsiskiria į kultūros terpę, išlaikydamos struktūrinį vientisumą ir funkcinį aktyvumą. Rekomenduojame taikyti dvigubo surinkimo metodą, kad būtų pasiektas maksimalus išeigos kiekis: 48 val. atlikti pirmąjį surinkimą, pakeisti šviežia terpe (sumažinta serumo koncentracija 2-5 % sumažina baltymų užterštumą) ir 72 val. atlikti antrąjį surinkimą. Ši strategija gali padidinti bendrą virusų išeigą 30-50 %, palyginti su vieno rinkimo protokolais. Renkant virusus labai svarbi temperatūra - visada palaikykite surinktą supernatantą 4 °C temperatūroje ir apdorokite per 24 valandas, kad titras labai nesumažėtų. Jei reikia didesnio grynumo, apsvarstykite galimybę paskutines 24 valandas rinkti į terpę be serumo, pavyzdžiui, mūsų RPMI 1640, nes tai supaprastina tolesnį gryninimą ir tik nežymiai paveikia išeigą. Venkite ilgesnio nei 72 val. auginimo, nes dėl sumažėjusio ląstelių gyvybingumo ir susikaupusių slopinančių atliekų produktų paprastai mažėja išeiga.

Virusų titrų supratimas ir optimizavimas

Naudojant mūsų optimizuotus protokolus su HEK293T ląstelėmis, nekoncentruotų lentiviro virusinių vektorių preparatų titrai, priklausomai nuo vektoriaus konstrukcijos ir gamybos parametrų, paprastai siekia nuo¹⁰⁷ iki¹⁰⁹ transdukuojančių vienetų mililitre (TU/ml). Šis intervalas atspindi funkcinį titrą, nustatomą pagal tikslinių ląstelių transdukciją, o ne fizinį dalelių skaičių, kuris gali būti 100-1000 kartų didesnis dėl neinfekcinių dalelių buvimo. Jei reikia didesnės koncentracijos, ultracentrifuguojant arba filtruojant tangentiniu srautu titrus galima padidinti 100-200 kartų, iki ^1010-1011 TU/ml. Vektoriaus dizainas turi didelę įtaką galutiniam išeigos kiekiui - savaime inaktyvuojantys vektoriai su minimaliu genetiniu krūviu paprastai duoda didesnį titrą nei sudėtingos konstrukcijos, viršijančios 7 kb. Kad gamybos rodikliai būtų nuoseklūs, rekomenduojame sukurti standartizuotą titravimo protokolą naudojant etaloninę ląstelių liniją, pavyzdžiui, A549 ląsteles, kurios pasižymi vidutiniu transdukcijos efektyvumu ir patikimomis augimo savybėmis. Jei išeiga nuolat nesiekia numatytų ribų, apsvarstykite galimybę įgyvendinti mūsų trikčių šalinimo darbo eigą, kurioje daugiausia dėmesio skiriama plazmidžių kokybei, transfekcijos efektyvumui arba alternatyvių gamybos ląstelių linijų, pavyzdžiui, mūsų HEK293-F, ištyrimui naudojant suspensinių kultūrų metodus, kurie gali gerokai pagerinti mastelio keitimą, išlaikant aukštus funkcinius titrus.