Išsamus ląstelių šaldymo vadovas: Ląstelių gyvybingumo ir sterilumo užtikrinimas
Ląstelių užšaldymas yra labai svarbus ląstelių kultūrų valdymo procesas, užtikrinantis ilgalaikį vertingų ląstelių linijų saugojimą ir išsaugojimą. Nesvarbu, ar dirbama su žmogaus, ar su gyvūnų ląstelėmis, sėkmingam kriokonservavimui svarbiausia laikytis tikslių protokolų ir griežtų aseptinių metodų.
Šiame vadove pateikiamos išsamios instrukcijos apie būtinas medžiagas, reagentus ir žingsnis po žingsnio atliekamas procedūras, kaip veiksmingai užšaldyti ląsteles išsaugant jų gyvybingumą ir sterilumą. Laikydamiesi šių rekomendacijų, tyrėjai gali drąsiai saugoti ir vėliau atgaivinti ląstelių kultūras su minimaliu ląstelių gyvybingumo praradimu, išlaikydami eksperimentų rezultatų vientisumą ir patikimumą.
Pirmiausia būtina sukurti sterilią darbo aplinką. Tinkami aseptiniai metodai yra labai svarbūs siekiant išvengti užteršimo ir užtikrinti kultūrų sterilumą.
Aseptinė technika
Viso proceso metu laikykitės aseptinių metodų, kad užtikrintumėte kultūrų sterilumą.
Išsamus ląstelių užšaldymo procesas
Šioje technologinėje schemoje pateikiamas išsamus vaizdinis vadovas apie esminius veiksmus, susijusius su tinkamu ląstelių užšaldymu. Vadovaukitės šiomis procedūromis, kad užtikrintumėte didelį ląstelių gyvybingumą ir vientisumą kriokonservavimo proceso metu.
Šaldymo terpės paruošimas
Paruoškite krioprotekcinę šaldymo terpę pagal ląstelių tipą:
- FBS turinčios terpės kultūros: 90 % FBS + 10 % DMSO arba 70 % augimo terpės, 20 % FBS ir 10 % DMSO
- Ląstelės, kurioms reikia glicerolio: 90 % FBS + 10 % glicerolio
Apsvarstykite galimybę įsigyti mūsų iš anksto paruoštą užšaldymo terpę:
- Šaldymo terpė CM-1: protokolams, kuriems reikia terpės su galvijų vaisiaus serumu (FBS)
- Užšaldymo terpė CM-ACF - be serumo: Alternatyvai be FBS
Ženklinimas ir dokumentai
Ženklinkite kriovialus, nurodydami šiuos duomenis:
- Data
- Tyrėjo vardas ir pavardė
- Ląstelės numeris
- Išėjimo numeris
- Ląstelės tipas
- Bet kokia papildoma informacija (pvz., genetinės modifikacijos)
Ląstelių paruošimas
Adherentinėms ląstelėms:
- Stebėkite ląsteles, kol jos pasieks 85-95 % susiliejimą
- Aspiruokite seną auginimo terpę
- Ląstelių monosluoksnį nuplaukite PBS be kalcio ir magnio
- Atskirkite ląsteles su Accutase, tripsinu arba tripsinu-EDTA ir, jei reikia, neutralizuokite su mitybine terpe
- Ląstelių suspensiją perkelkite į 50 ml "Falcon" mėgintuvėlį
Suspensijos ląstelėms:
- Ląstelių tankį ir būklę patikrinkite mikroskopu
- Ląstelių suspensiją perkelkite tiesiai į 50 ml "Falcon" mėgintuvėlį
Ląstelių skaičiavimas ir centrifugavimas
- Suskaičiuokite ląsteles naudodami hemociometrą arba automatinį ląstelių skaitiklį
- 3-5 min. kambario temperatūroje centrifuguoti 300 g sūkių greičiu, kad ląstelės būtų išsklaidytos
- Atsargiai aspiruokite supernatantą, vengdami pažeisti ląstelių granules
- Prieš naudojimą pašildykite paruoštą šaldymo terpę iki 37 °C temperatūros
Kriokonservavimas
- Resuspenduokite ląstelių granules šaldymo terpėje iki 2,0 mln. ląstelių/ml adherentinių ir 5 mln. ląstelių/ml suspensinių ląstelių tankio arba norimos koncentracijos
- 1,0 ml (arba daugiau, jei reikia) ląstelių suspensijos supilkite į paženklintus kriovizorius
- Prieš perkeldami ląsteles į ilgalaikį saugojimą, naudokite lėto šaldymo metodą
| ? Metodas | ? Žingsniai |
|---|---|
|
❄️ Rankinis užšaldymas |
1️⃣ Įdėkite ląsteles į užšaldymo terpę ir 40 minučių palaikykite 4 °C temperatūros šaldiklyje. 2️⃣ Perkelkite į -80°C šaldiklį 24 valandoms. 3️⃣ Ilgalaikiam saugojimui ląsteles laikykite skystame azote |
|
? "Mr. Frosty" naudojimas |
1️⃣ Paruoškite ląsteles į kriokūnelius su užšaldymo terpe. 2️⃣ Įdėkite kriovialus į "Mr. Frosty" talpyklą. 3️⃣ Prieš perkeldami į skystą azotą, 24 valandas laikykite -80 °C temperatūroje |
|
? Kontroliuojamo greičio šaldiklis |
1️⃣ Užprogramuokite prietaisą palaipsniui mažinti temperatūrą. 2️⃣ Paruoštas ląsteles įdėkite į šaldiklį. 3️⃣ Po šaldymo ciklo ląsteles perkelkite į skystą azotą |
- Laikykite kriovaistines žemesnėje nei -130 °C temperatūroje arba skystame azote, kad galėtumėte jas ilgai saugoti.
Medžiagos ir reagentai
- 1-2 ml talpos kriovaistinės
- "CoolCell®" šaldymo įrenginys arba kontroliuojamo greičio šaldiklis
- Krioprotekcinė šaldymo terpė (pvz., "pasidaryk pats" krioprotekcinė terpė, CM-1, CM-ACF arba specializuota terpė)
- Fetalinis galvijų serumas (FBS) arba kondicionuota terpė
- DMSO arba glicerolis
- PBS be kalcio ir magnio
- Akutazė, tripsinas arba tripsinas-EDTA (adhezinėms ląstelėms)
- 15 ml arba 50 ml "Falcon" mėgintuvėliai
- Hemocitometras arba automatinis ląstelių skaitiklis
- Centrifuga