Paskelbta: 2023 m. | Paskutinis peržiūrėjimas: 2026 m. gegužė

Išsamus ląstelių užšaldymo vadovas: gyvybingumo ir sterilumo užtikrinimas

Ląstelių užšaldymas yra kritinis procesas ląstelių kultūrų tvarkyboje, užtikrinantis vertingų ląstelių linijų ilgalaikį saugojimą ir išsaugojimą. Nesvarbu, ar dirbama su žmogaus, ar gyvūnų ląstelėmis, norint sėkmingai atlikti kriokonservavimą, būtina laikytis tikslių protokolų ir griežtų aseptikos reikalavimų.

Šiame vadove pateikiamos išsamios instrukcijos dėl reikalingų medžiagų, reagentų ir žingsnis po žingsnio procedūrų, skirtų veiksmingai užšaldyti ląsteles, išsaugant jų gyvybingumą ir sterilumą. Laikydamiesi šių gairių, mokslininkai gali drąsiai saugoti ir vėliau atgaivinti ląstelių kultūras, patirdami minimalų ląstelių gyvybingumo praradimą, taip išlaikydami eksperimentų rezultatų vientisumą ir patikimumą.

Pirmiausia būtina sukurti sterilią darbo aplinką. Tinkamos aseptinės technikos atlieka lemiamą vaidmenį užkertant kelią užteršimui ir užtikrinant kultūrų sterilumą.

Aseptinė technika

Visą procesą laikykitės aseptinių metodų, kad užtikrintumėte kultūrų sterilumą.

Išsamus ląstelių užšaldymo procesas

Ši schema pateikia išsamų vizualų vadovą, apimantį esminius žingsnius, reikalingus tinkamam ląstelių užšaldymui. Laikykitės šių procedūrų, kad užtikrintumėte aukštą ląstelių gyvybingumą ir vientisumą kriokonservavimo proceso metu.

Šaldymo terpės paruošimas

Paruoškite krioprotektyvinę šaldymo terpę pagal ląstelių tipą:

FBS turinčios kultūros: 90 % FBS + 10 % DMSO arba 70 % auginimo terpės, 20 % FBS ir 10 % DMSO
Ląstelės, kurioms reikalingas glicerolis: 90 % FBS + 10 % glicerolio

Apsvarstykite galimybę įsigyti mūsų iš anksto paruoštą šaldymo terpę:

Šaldymo terpė CM-1: protokolams, kuriems reikalinga terpė, kurioje yra veršelių serumo (FBS)
Šaldymo terpė CM-ACF – be serumo: FBS neturinti alternatyva

Ženklinimas ir dokumentacija

Pažymėkite kriovialus šiais duomenimis:

Data
Tyrėjo vardas ir pavardė
Ląstelių skaičius
Perkėlimo numeris
Ląstelių tipas
Bet kokia papildoma informacija (pvz., genetinės modifikacijos)

Ląstelių paruošimas

Adhezyvinių ląstelių atveju:

Stebėkite ląsteles, kol jos pasieks 85–95 % konfluenciją
Išsiurbkite seną kultūrinę terpę
Nuplaukite ląstelių monosluoksnį kalcio ir magnio neturinčiu PBS
Atskirti ląsteles naudojant „Accutase“, tripsiną arba tripsiną-EDTA ir, jei reikia, neutralizuoti auginimo terpe
Perkelkite ląstelių suspensiją į 50 ml „Falcon“ mėgintuvėlį

Suspensijos ląstelėms:

Patikrinkite ląstelių tankį ir būklę mikroskopu
Perkelkite ląstelių suspensiją tiesiai į 50 ml „Falcon“ mėgintuvėlį

Ląstelių skaičiavimas ir centrifugavimas

Suskaičiuokite ląsteles naudodami hemocitometrą arba automatinį ląstelių skaitiklį
Centrifuguokite 300 g greičiu 3–5 minutes kambario temperatūroje, kad ląstelės nusėstų
Atsargiai nusiurbkite supernatantą, stengdamiesi nesutrikdyti ląstelių nuosėdų
Prieš naudojimą paruoštą šaldymo terpę pašildykite iki 37 °C

Kriokonservavimas

Ląstelių nuosėdas resuspenduokite šaldymo terpėje iki 2,0 mln. ląstelių/ml tankio adhezyvinių ląstelių atveju ir 5 mln. ląstelių/ml tankio suspensinių ląstelių atveju arba iki pageidaujamos koncentracijos
Į paženklintus kriovialus įpilkite 1,0 ml (arba daugiau, jei reikia) ląstelių suspensijos
Prieš perkeliant ląsteles į ilgalaikio saugojimo vietą, naudokite lėto užšaldymo metodą

? Metodas: ? Veiksmai
❄️ Rankinis užšaldymas: 1️⃣ Ląsteles sušaldymo terpėje padėkite į 4 °C šaldiklį 40 minučių.
2️⃣ Perkelkite į -80 °C šaldiklį 24 valandoms.
3️⃣ Ląsteles laikykite skystame azote ilgalaikiam saugojimui.
? Naudojant „Mr. Frosty“: 1️⃣ Paruoškite ląsteles kriovialėse su užšaldymo terpe.
2️⃣ Įdėkite krioviales į „Mr. Frosty“ indą.
3️⃣ Laikykite -80 °C temperatūroje 24 valandas, prieš perkeliant į skystą azotą.
? Šaldiklis su reguliuojamu greičiu: 1️⃣ Nustatykite prietaisą taip, kad temperatūra palaipsniui mažėtų.
2️⃣ Įdėkite paruoštas ląsteles į šaldiklį.
3️⃣ Po užšaldymo ciklo perkelkite ląsteles į skystą azotą.

Kriovialus laikykite temperatūroje, žemesnėje nei -130 °C, arba skystame azote ilgalaikiam saugojimui.

Medžiagos ir reagentai

1–2 ml kriovialės
„CoolCell®“ šaldymo įrenginys arba šaldiklis su reguliuojamu greičiu
Krioprotektyvinė užšaldymo terpė (pvz., savos gamybos krioprotektyvinė terpė, CM-1, CM-ACF arba specializuota terpė)
Veršelių serumas (FBS) arba kondicionuota terpė
DMSO arba glicerolis
Kalcio ir magnio neturintis PBS
Accutase, tripsinas arba tripsinas-EDTA (prisitvirtinusioms ląstelėms)
15 ml arba 50 ml „Falcon“ mėgintuvėliai
Hemocitometras arba automatinis ląstelių skaičiuoklis
Centrifuga