Ląstelių kultūrų disociacijos metodai

Ląstelių kultūrų disociacija yra labai svarbus ląstelių kultūrų palaikymo etapas. Jis apima ląstelių atskyrimą nuo jų augimo paviršiaus, kad jas būtų galima subkultūruoti arba surinkti derlių. Šiame skirsnyje aprašomi du pagrindiniai metodai: disociacijos buferių be fermentų naudojimas ir fermentinių reagentų naudojimas.

1.ląstelių disociacijos buferių be fermentų naudojimas

Šis metodas yra švelnus ir išlaiko ląstelių vientisumą nenaudojant fermentų:

1. Paruošimas
   • Prieš naudodami visus reagentus pašildykite iki 37 °C, kad ląstelės nepatirtų šoko.
2. Augimo terpės pašalinimas
   • Išmeskite seną augimo terpę iš auginimo indo.
3. Skalavimas
   • Kiekvieną T75 kolbą arba 100 mm lėkštelę nuplaukite 5 ml PBS be kalcio ir magnio.
   • Švelniai supurtykite indą 30-60 sekundžių kambario temperatūroje.
   • Išsiurbkite ir išmeskite skalavimo tirpalą.
   • Šį skalavimo etapą pakartokite dar kartą.
4. Disociacija
   • Į indą įpilkite maždaug 5 ml ląstelių disociacijos buferio be fermentų.
   • Švelniai 1-2 min. sujudinkite kambario temperatūroje ir patikrinkite, ar vyksta disociacija mikroskopu.
   • Jei reikia, trenkite kolbą ar indą ranka, kad ląstelės išsisklaidytų.
   • Jei ląstelės sukibę, leiskite joms dar 2-5 minutes pabūti kambario temperatūroje ir, jei reikia, dar kartą papurtykite, naudodami daugiau disociacijos buferinio tirpalo.
   • Kai ląstelės atsiskiria, įpilkite bent 5 ml visavertės augimo terpės, kad neutralizuotumėte disociacijos buferinį tirpalą, ir vėl suspenduokite ląsteles.
5. Gyvybingumo patikrinimas
   • Subkultūrinimo metu stebėkite ląstelių gyvybingumą ir įsitikinkite, kad jis išlieka didesnis nei 90 %.

2.kitų reagentų naudojimas disociacijai

Šiuo metodu galima naudoti įvairius disociacijos reagentus:

1. Naudotos terpės pašalinimas
   • Išmeskite seną terpę iš auginimo indo.
2. Ląstelių plovimas
   • Ląstelės plaunamos subalansuotu druskos tirpalu, kuriame nėra kalcio ir magnio, arba naudokite EDTA.
   • Švelniai įpilkite plovimo tirpalo į priešingą ląstelėms pusę ir 1-2 min. supurtykite indą, prieš išmesdami plovimo tirpalą.
3. Disociacija
   • Užpilkite 2-3 ml pasirinkto disociacijos tirpalo 25 cm² augimo paviršiaus, kad būtų padengtas ląstelių sluoksnis.
   • Inkubuokite indą 37 °C temperatūroje ir švelniai supurtykite. Priklausomai nuo ląstelių linijos, disociacija paprastai įvyksta per 5-15 minučių.
   • Jei ląstelės užsispyrusios, procesą galima pagreitinti bakstelėjus indą.
   • Atidžiai stebėkite ląsteles, kad išvengtumėte per didelės ekspozicijos ir galimo pažeidimo.
4. Ląstelių surinkimas
   • Kai ląstelės visiškai atsiskiria, leiskite joms susikaupti indo dugne, pastatę indą vertikaliai.
   • Įpilkite pilnos terpės, tada išsklaidykite ir surinkite ląsteles pipete perbraukdami per ląstelių sluoksnį.
   • Suskaičiuokite ir tęskite subkultūrinimą.

Taikant abu metodus, svarbu empiriniais stebėjimais nustatyti optimalias sąlygas kiekvienai ląstelių linijai. Procesas turėtų išsaugoti ląstelių gyvybingumą, kuris turėtų būti reguliariai tikrinamas, kad subkultūrinimo metu viršytų 90 %. Šios procedūros yra pagrindas, kurį tyrėjai gali pritaikyti atsižvelgdami į konkrečius savo ląstelių linijų reikalavimus ir savybes.

3.adherentinių ląstelių subkultūrinimo metodų apžvalga

Norint veiksmingai subkultūruoti adherentines ląsteles, reikia jas atskirti nuo kultūros indo. Taikomi įvairūs metodai, kurių kiekvienas tinka skirtingiems ląstelių tipams ir sąlygoms. Renkantis atskyrimo metodą, labai svarbu atsižvelgti į konkrečius ląstelių linijos poreikius ir eksperimento tikslus. Reguliarus ląstelių gyvybingumo stebėjimas, siekiant, kad subkultūrinimo metu jų gyvybingumas būtų didesnis nei 90 %, yra labai svarbus siekiant užtikrinti nuolatinę kultūros sveikatą ir produktyvumą. Čia pateikiama šių procedūrų apžvalga: