Paskelbta: 2023 m. | Paskutinis peržiūrėjimas: 2026 m. gegužė

Ląstelių kultūros atskyrimo metodai

Ląstelių kultūros atskyrimas yra svarbus ląstelių kultūros priežiūros etapas. Jis apima ląstelių atskyrimą nuo augimo paviršiaus, kad būtų galima atlikti subkultūravimą arba derliaus nuėmimą. Šiame skyriuje aprašomi du pagrindiniai metodai: naudojant fermentų neturinčius atskyrimo buferius ir naudojant fermentinius reagentus.

Ląstelių atskyrimo buferių be fermentų naudojimas

Šis metodas yra švelnus ir leidžia išlaikyti ląstelių vientisumą nenaudojant fermentų:

1. Pasirengimas
   • Prieš naudojimą įsitikinkite, kad visi reagentai yra pašildyti iki 37 °C, kad ląstelės nepatirtų šoko.
2. Auginimo terpės pašalinimas:
   • Išmeskite seną auginimo terpę iš kultūros indelio.
3. Praskalaukite
   • Nuplaukite ląstelių monosluoksnius 5 ml kalcio ir magnio neturinčio PBS tirpalo kiekvienam T75 kolbai arba 100 mm lėkštelei.
   • Švelniai pakratykite indą 30–60 sekundžių kambario temperatūroje.
   • Išsiurbkite ir išmeskite skalavimo tirpalą.
   • Pakartokite šį skalavimo etapą dar kartą.
4. Disociacija
   • Į indą įpilkite maždaug 5 ml fermentų neturinčio ląstelių disociacijos buferio.
   • Švelniai pakratykite kambario temperatūroje 1–2 minutes ir mikroskopu patikrinkite, ar ląstelės atsiskyrė.
   • Jei reikia, kolbą ar indą lengvai pabaksnokite delnu, kad ląstelės atsiskirtų.
   • Jei ląstelės yra prilipusios, palikite jas kambario temperatūroje dar 2–5 minutes ir, jei reikia, vėl pabelskite, naudodami daugiau disociacijos buferio.
   • Kai ląstelės atsiskirs, įpilkite ne mažiau kaip 5 ml pilnos auginimo terpės, kad neutralizuotumėte disociacijos buferį ir vėl suspenduotumėte ląsteles.
5. Gyvybingumo patikrinimas
   • Stebėkite ląstelių gyvybingumą per subkultūravimą, užtikrindami, kad jis išliktų didesnis nei 90 %.

Kitų reagentų naudojimas disociacijai

Šis metodas leidžia naudoti įvairius disociacijos reagentus:

1. Naudotos terpės pašalinimas
   • Išmeskite seną terpę iš kultūros indo.
2. Ląstelių plovimas
   • Ląsteles nuplaukite subalansuotu druskų tirpalu, kuriame nėra kalcio ir magnio, arba naudokite EDTA.
   • Plaunamąjį tirpalą atsargiai įpilkite į pusę, priešingą ląstelėms, ir 1–2 minutes pakratykite indą, prieš išpilant plaunamąjį tirpalą.
3. Disociacija
   • Įpilkite 2–3 ml pasirinktos disociacijos tirpalo 25 cm² auginimo paviršiaus, užtikrinant, kad jis padengtų visą ląstelių sluoksnį.
   • Inkubuokite indą 37 °C temperatūroje ir švelniai pakratykite. Disociacija paprastai įvyksta per 5–15 minučių, priklausomai nuo ląstelių linijos.
   • Jei ląstelės sunkiai atsiskiria, procesą galima pagreitinti lengvai pabeldžiant į indą.
   • Atidžiai stebėkite ląsteles, kad išvengtumėte per ilgo veikimo ir galimo pažeidimo.
4. Ląstelių surinkimas
   • Kai ląstelės visiškai atsiskiria, leiskite joms susikaupti indo dugne, pastatydami jį vertikaliai.
   • Įpilkite pilną terpę, tada išsklaidykite ir surinkite ląsteles pipete per ląstelių sluoksnį.
   • Suskaičiuokite ląsteles ir tęskite subkultūravimą.

Abiem metodais svarbu empiriškai stebint nustatyti optimalias sąlygas kiekvienai ląstelių linijai. Šis procesas turėtų išsaugoti ląstelių gyvybingumą, kuris subkultūravimo metu turėtų būti reguliariai tikrinamas ir viršyti 90 %. Šios procedūros suteikia pagrindą tyrėjams prisitaikyti prie konkrečių savo ląstelių linijų reikalavimų ir savybių.

Adhezyvinių ląstelių subkultūravimo metodų apžvalga

Veiksmingam adhezyvinių ląstelių subkultūravimui reikia jas atskirti nuo kultūros indo. Taikomi įvairūs metodai, kiekvienas iš jų tinka skirtingiems ląstelių tipams ir sąlygoms. Renkantis atskyrimo metodą, labai svarbu atsižvelgti į konkrečius ląstelių linijos poreikius ir eksperimento tikslus. Reguliarus ląstelių gyvybingumo stebėjimas, siekiant, kad subkultūravimo metu jis būtų didesnis nei 90 %, yra būtinas norint užtikrinti nuolatinę kultūros sveikatos būklę ir produktyvumą. Čia pateikiama šių procedūrų apžvalga: