HaCaT ląstelės – odos biologijos ir ligų tyrimai
HaCaT ląstelės yra gautos iš žmogaus epidermio keratinocitų ir dažniausiai naudojamos epidermio homeostazei bei su ja susijusioms patologijoms tirti. Šios ląstelės laikomos savaime nemirtingomis žmogaus keratinocitų ląstelėmis, o tai yra svarbu, nes jos buvo gautos iš normalių odos keratinocitų, nepatyrusių krizės ar augimo sulėtėjimo. Dėl šios unikalios kilmės HaCaT ląstelės turi genetinių ir augimo savybių rinkinį, kuris skiriasi nuo kitų ląstelių linijų. Nepaisant to, kad in vitro jos rodo transformuotą fenotipą su klonogeninėmis savybėmis ant agaro ar plastiko, HaCaT ląstelių linija išlieka netumorigeninė. Būdamos pirmąja stabilia epitelio ląstelių linija iš suaugusio žmogaus odos, kuri rodo normalią diferenciaciją, HaCaT ląstelės yra vertinga priemonė tirti keratinizacijos reguliavimą žmogaus ląstelėse. Šios ląstelės turi platų pritaikymo spektrą dėl savo gebėjimo veiksmingai daugintis ir diferencijuotis in vitro.
- Auginimo terpė
- Žiūrėti produkto puslapį
- Padvigubėjimo laikas
- Žiūrėti produkto puslapį
- Augimo tipas
- Adhezinis
- Biologinio saugumo lygis
- BSL-1
- Galima įsigyti
- Cytion — Užsakyti HaCaT
- HaCaT ląstelių charakteristikos
- HaCaT ląstelių genetinės savybės ir kilmė
- Kaip surinkti HaCaT ląsteles per 5 paprastus žingsnius
- HaCaT ląstelių pritaikymas
- Rekomenduojami vaizdo įrašai: HaCaT ląstelių pasaulio tyrinėjimas
HaCaT ląstelių savybės
HaCaT ląstelės gali būti auginamos esant žemam kalcio kiekiui ir yra verpstės formos, be ląstelių tarpusavio jungčių, kaip ir pirminės ląstelės, auginamos tomis pačiomis sąlygomis. Normaliame epidermyje keratinocitai vystosi iš kamieninių ląstelių baziniame sluoksnyje ir pereina per spygliuotąjį bei grūdėtąjį sluoksnius, kol pasiekia rageninį sluoksnį ir nusilupa į aplinką. Šis griežtai reguliuojamas pusiausvyros tarp proliferacijos ir nusilupimo rezultatas – visiškas atsinaujinimas arba pasikeitimas kas 28 dienas, sudėtingas procesas, žinomas kaip keratinizacija. Šis procesas yra griežtai reguliuojamas ir apima žymius genų ekspresijos, struktūrinės sandaros ir fermentinės veiklos pokyčius. In vitro ir in vivo tyrimams HaCaT ląstelės turi išlaikyti epiderminius keratinus, būdingus diferencijuotiems žmogaus epidermio ląstelių sluoksniams, kurie yra būtini odos struktūrinei vientisumui ir atsparumui išlaikyti. Nors HaCaT ląstelėse gali įvykti nuoseklios chromosomų mutacijos, jos gali būti nesusijusios su reikšmingomis diferenciacijos problemomis, o vietoj to rodo spontanišką suaugusių žmonių keratinocitų transformaciją in vitro.
HaCaT ląstelių genetinės savybės ir kilmė
HaCaT ląstelės yra savaime nemirtingos žmogaus keratinocitų ląstelių linija, kilusi iš suaugusiojo odos ir atspindinti unikalią evoliucijos trajektoriją. Šios ląstelės turi mutacijas abiejuose p53 geno aleliuose, kas yra būdinga UV spindulių sukeltoms mutacijoms [3,4]. Be to, manoma, kad HaCaT ląstelės susiformavo dėl p53 naviko slopinančio geno mutacijų, po kurių sekė senėjimo genų praradimas [5].
Naviko slopinančiojo geno p53, žinomo dėl savo vaidmens DNR remontui ir kaip genomo sargybinio, indukuoja žmogaus odos reakciją į DNR pažeidimus [4]. Buvo pastebėta, kad HaCaT ląstelės iš dalies prarado savo apsaugos mechanizmą nuo DNR pažeidimų dėl p53 geno mutacijos in vivo, todėl jos tampa jautrios citogenetinių pokyčių kaupimuisi reaguodamos į padidėjusias kultūrinės terpės temperatūras. Kitas HaCaT ląstelių nemirtingumo mechanizmas susijęs su padidėjusiu telomerazės fermento aktyvumu [7]. Normaliose ląstelėse telomerai nuolat trumpėja su kiekvienu ląstelių dalijimusi, kol pasiekiamas ląstelių senėjimas. Telomerazė yra specializuotas ląstelinis fermentų kompleksas su atvirkštinės transkriptazės aktyvumu, kuris palaiko stabilų telomerų ilgį. Priešingai, HaCaT ląstelėse telomerazės aktyvumas yra žymiai padidėjęs, todėl telomerų ilgis gerai išlaikomas. Šie stebėjimai patvirtina telomerazės vaidmenį HaCaT ląstelių nemirtingumo procese.
Buvo identifikuotos trys specifinės chromosomų translokacijos, dėl kurių prarandama viena chromosomų 3p, 4p ir 9p rankų kopija, atsiranda 9q ir susidaro izochromosomos. 3p chromosomos trumposios rankos praradimas gali lemti senėjimo genų praradimą ir HaCaT ląstelių nemirtingumą [8]. HaCaT ląstelės yra hipodiploidinės ir turi aiškias bei stabilias žymeklines chromosomas, rodančias jų monokloninę kilmę. HaCaT ląstelių linijos charakteristikos ir kilmė buvo patvirtintos naudojant DNR pirštų atspaudų analizę su hipervariabiliais minisatelitų žymekliais [3–6].
Kaip surinkti HaCaT ląsteles per 5 paprastus žingsnius
- Pašalinkite auginimo terpę ir nuplaukite prisitvirtinusias ląsteles, naudodami 3–5 ml PBS be kalcio ir magnio T25 kolboms arba 5–10 ml T75 kolboms.
- Į kiekvieną T25 kolbą įpilkite 1–2 ml šviežiai paruošto 0,05 % EDTA tirpalo, o į T75 kolbą – 2,5 ml, užtikrindami, kad būtų padengtas visas ląstelių sluoksnis, ir inkubuokite 37 °C temperatūroje 10 minučių.
- Į kiekvieną T25 kolbą įpilkite 1 ml šviežiai paruošto tripsino/EDTA (0,05 %/0,025 %) tirpalo, o į T75 kolbą – 2,5 ml, vėl užtikrindami, kad ląstelių sluoksnis būtų visiškai padengtas. Ląstelės turėtų atsiskirti per 1–2 minutes.
- Sustabdykite tripsino aktyvumą, įpilant FBS turinčios ląstelių kultūros terpės.
- Perkelkite ląsteles į naujus kolbelius su šviežia ląstelių kultūros terpe.
HaCaT ląstelių pritaikymas
HaCaT ląstelės yra vertinga priemonė keratinocitų tyrimams [9]. Šios nemirtingos ląstelės veikia kaip preneoplastinės ląstelės ir gali suteikti įžvalgų apie pokyčius, susijusius su piktybine ir neoplastine transformacija [10]. Vienos sluoksnio HaCaT ląstelių kultūros yra būtinos ląstelių toksiškumo ir in vitro žaizdų gijimo analizės taikymams. HaCaT ląstelės taip pat gali būti naudojamos įvairių veiksnių sukeliamam odos toksiškumui ir neoplastiniams ar uždegiminiams procesams vertinti. Jos gali būti naudojamos įvairių odos alerginių reakcijų mechanizmų, reaktyviųjų deguonies rūšių poveikio ir UV spinduliavimo analizei. Stimuliuojamos HaCaT ląstelės gali diferencijuotis ir išreikšti specifinius diferenciacijos žymenis, pvz., involucriną, K14 ir K10. HaCaT ląstelės taip pat dažnai naudojamos kaip modelis epidermio homeostazės patofiziologijai tirti [6].
HaCaT ląstelės po persodinimo išlaiko gebėjimą in vivo atkurti struktūrizuotą epidermį, dėl to susidaro sluoksniuota epidermio struktūra, kurią galima perjungti iš bazalinės į diferencijuotą būseną keičiant kalcio koncentraciją terpėje. Šios ląstelės taip pat leidžia charakterizuoti keletą biologinių procesų, pavyzdžiui, jas galima naudoti kaip vitamino D modelio sistemą ir tirti medžiagų apykaitą odoje. Kadangi HaCaT ląstelės nėra genetiškai modifikuotos, jos suteikia nešališką vaizdą apie platų pradinių genetinių procesų spektrą žmogaus odoje.
Rekomenduojami vaizdo įrašai: HaCaT ląstelių pasaulio tyrinėjimas
„HaCaT ląstelių migracija“: Šiame vaizdo įraše parodomas HaCaT ląstelių migracijos procesas. Ląstelių migracija yra esminis procesas įvairiems biologiniams procesams, pavyzdžiui, žaizdų gijimui ir vėžio metastazavimui. Vaizdo įraše mikroskopu stebimas HaCaT ląstelių judėjimas, pateikiant vizualų šių ląstelių migracijos vaizdą. Stebima ląstelių veikla, kai jos juda iš vienos vietos į kitą, o vaizdo įraše aiškiai iliustruojami pokyčiai, vykstantys ląstelėse šio proceso metu.
„HaCaT ląstelių įbrėžimo testas“: Šiame vaizdo įraše parodomas HaCaT ląstelių įbrėžimo testas. „Scratch Assay“ yra plačiai naudojama ląstelių migracijos tyrimo technika, o šiuo atveju ji naudojama HaCaT ląstelių migracijai analizuoti. Vaizdo įraše parodomas įbrėžimo sukūrimo procesas ant ląstelių kultūros lėkštelės paviršiaus, kuris vėliau stebimas mikroskopu, kai HaCaT ląstelės migruoja ir laikui bėgant užpildo tarpą.
„HaCaT keratinocitų auginimas žaizdų gijimo eksperimentams“: Šiame vaizdo įraše parodomas HaCaT keratinocitų auginimo procesas žaizdų gijimo eksperimentams. HaCaT keratinocitai yra dažnai naudojama ląstelių linija žaizdų gijimo tyrimuose.
„HaCaT ląstelių diferenciacija“: Šiame vaizdo įraše parodomi būtini HaCaT ląstelių diferenciacijos etapai. HaCaT ląstelės gali diferencijuotis į įvairių tipų odos ląsteles. Vaizdo įraše parodomi HaCaT ląstelių pokyčiai diferenciacijos metu, vizualiai pavaizduojant įvairius diferenciacijos žymeklius ir charakteristikas. Diferenciacijos procesas yra labai svarbus normaliam odos funkcionavimui, o vaizdo įraše pabrėžiamos skirtingos HaCaT ląstelių diferenciacijos stadijos.
Nuorodos
- Angel P ir Karin M: Jun, Fos ir AP-1 komplekso vaidmuo ląstelių proliferacijoje ir transformacijoje. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: Epidermio hiperplastinio augimo reguliavimas. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Spontaniškai atsiradusios ilgai gyvenančios žmogaus keratinocitų linijos (NM-1) izoliavimas ir charakterizavimas. In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutacijos žmogaus nemirtingose epitelio ląstelių linijose. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Dėl saulės spindulių atsirandančios mutacijų židinių vietos p53 gene ne melanominio odos vėžio atveju. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. Daugialypiai etapai ir genetiniai pokyčiai žmogaus odos keratinocitų nemirtingumo, piktybinės transformacijos ir naviko progresavimo procesuose. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
- Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerazės aktyvumas žmogaus odos epidermio regeneraciniame baziniame sluoksnyje ir nemirtinguose bei iš karcinomos kilusiuose odos keratinocituose. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT ląstelės kaip patikimas in vitro diferenciacijos modelis žmogaus keratinocitų uždegiminės/atstatomosios reakcijos analizei. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
- Boukamp, P. ir kt. Normalus keratinizavimas spontaniškai nemirtingose aneuploidinėse žmogaus keratinocitų ląstelių linijose. J. Cell Biol. 106, 1996, 761–771.
- Gibbs, Graham: Kokybinių duomenų analizė. „The Sage“ kokybinių tyrimų rinkinys. Londonas: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Taikomojo tyrimo projektas: praktinis vadovas. Sage: Londonas
- Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normalus keratinizavimas spontaniškai nemirtingose aneuploidinėse žmogaus keratinocitų ląstelių linijose. Cell Biol. (1988); 106: 761–771.