HaCaT ląstelės - odos biologijos ir ligų tyrimai

2.haCaT ląstelių genetinės savybės ir kilmė

HaCaT ląstelės yra spontaniškai imortalizuota žmogaus keratinocitų ląstelių linija, kilusi iš suaugusių žmonių odos ir atspindinti unikalų evoliucijos kelią. Šios ląstelės turi abiejų p53 geno alelių mutacijas, kurios būdingos UV spinduliuotės sukeltoms mutacijoms [3,4]. Be to, manoma, kad HaCaT ląstelės susidarė dėl p53 naviką slopinančio geno mutacijų, po kurių buvo prarasti senėjimo genai [5].

Naviką slopinantis genas p53, žinomas dėl savo vaidmens DNR taisymo procese ir kaip genomo sargas, sukelia žmogaus odos atsaką į DNR pažeidimus [4]. Pastebėta, kad HaCaT ląstelės iš dalies prarado apsaugos nuo DNR pažeidimų mechanizmą dėl in vivo įvykusios p53 geno mutacijos, todėl jos tampa jautrios kauptis citogenetiniams pokyčiams reaguojant į padidėjusią kultūros temperatūrą. Kitas HaCaT ląstelių imortalizacijos mechanizmas susijęs su padidėjusiu telomerazės fermento aktyvumu [7]. Normaliose ląstelėse telomerai nuolat trumpėja su kiekvienu ląstelės dalijimusi, kol pasiekiamas ląstelių senėjimas. Telomerazė yra specializuotas ląstelių fermentų kompleksas, pasižymintis atvirkštinės transkriptazės aktyvumu, kuris palaiko stabilų telomerų ilgį. Priešingai, HaCaT ląstelėse telomerazės aktyvumas yra gerokai padidėjęs, todėl telomerų ilgis gerai išlieka. Šie stebėjimai patvirtina telomerazės vaidmenį HaCaT ląstelių imortalizacijos procese.

Nustatytos trys specifinės chromosomų translokacijos, dėl kurių prarandama viena 3p, 4p ir 9p chromosomų atšakų kopija, įgyjama 9q ir susidaro izochromosomos. Dėl trumpojo chromosomos 3p peties praradimo gali būti prarandami senėjimo genai ir HaCaT ląstelės imortalizuojamos [8]. HaCaT ląstelės yra hipodiploidinės ir turi atskiras ir stabilias žymėtąsias chromosomas, rodančias jų monokloninę kilmę. HaCaT ląstelių linijos savybės ir galva buvo patvirtintos naudojant DNR pirštų atspaudus su hipervariaciniais minisatelitiniais žymenimis [3-6].

3.kaip surinkti HaCaT ląsteles 5 paprasti žingsniai

4. Pašalinkite auginimo terpę ir nuplaukite prilipusias ląsteles naudodami 3-5 ml PBS be kalcio ir magnio T25 kolboms arba 5-10 ml T75 kolboms.
5. Įpilkite 1-2 ml šviežiai paruošto 0,05 % EDTA tirpalo į T25 kolbą arba 2,5 ml į T75 kolbą, kad būtų padengtas visas ląstelių sluoksnis, ir 10 minučių inkubuokite 37 °C temperatūroje.
6. Įpilkite 1 ml šviežiai paruošto tripsino ir EDTA (0,05 %/0,025 %) tirpalo į vieną T25 kolbą arba 2,5 ml į vieną T75 kolbą, vėlgi užtikrindami, kad būtų padengtas visas ląstelių sluoksnis. Ląstelės turėtų atsiskirti per 1-2 minutes.
7. Sustabdykite tripsino aktyvumą, įpilkite FBS turinčios ląstelių kultūros terpės.
8. Išpilstykite ląsteles į naujas kolbas su šviežia ląstelių kultūrų terpe.

4. HaCaT ląstelių panaudojimas

HaCaT ląstelės yra vertinga priemonė keratinocitams tirti [9]. Šios nemirtingos ląstelės veikia kaip preneoplastinės ląstelės ir gali padėti išsiaiškinti pokyčius, susijusius su piktybine ir navikine transformacija [10]. Viensluoksnės HaCaT ląstelių kultūros yra būtinos ląstelių toksiškumo ir žaizdų gijimo in vitro analizės taikymams. HaCaT ląstelės taip pat gali būti naudojamos įvairių medžiagų ir neoplastinių ar uždegiminių procesų sukeltam odos toksiškumui vertinti. Jos gali būti naudojamos analizuojant įvairius odos alerginių reakcijų mechanizmus, reaktyvių deguonies rūšių poveikį ir UV spinduliuotės poveikį. Stimuliuojamos HaCaT ląstelės gali diferencijuotis ir išreikšti specifinius diferenciacijos žymenis, tokius kaip involukrinas, K14 ir K10. HaCaT ląstelės taip pat dažnai naudojamos kaip modelis epidermio homeostazės patofiziologijai tirti [6].

HaCaT ląstelės po transplantacijos išsaugo gebėjimą atkurti struktūrizuotą epidermį in vivo, todėl susiformuoja sluoksniuota epidermio struktūra, kurią galima keisti iš bazinės į diferencijuotą, keičiant kalcio koncentraciją terpėje. Šios ląstelės taip pat leidžia charakterizuoti keletą biologinių procesų, pavyzdžiui, naudoti jas kaip vitamino D modelinę sistemą ir metabolizmą odoje. Kadangi HaCaT ląstelės nėra genetiškai modifikuotos, jos suteikia nešališką vaizdą apie platų pradinių genetinių įvykių žmogaus odoje spektrą.

5. Rekomenduojami vaizdo įrašai: HaCaT ląstelių pasaulio tyrinėjimas

"HaCaT ląstelių migracija": Šiame vaizdo įraše pristatomas HaCaT ląstelių migracijos procesas. Ląstelių migracija yra esminis įvairių biologinių procesų, pavyzdžiui, žaizdų gijimo ir vėžio metastazių, procesas. Vaizdo įraše demonstruojamas HaCaT ląstelių judėjimas per mikroskopą, vaizdžiai parodant, kaip šios ląstelės migruoja. Stebimas ląstelių aktyvumas joms judant iš vienos vietos į kitą, o vaizdo įraše aiškiai iliustruojami šio proceso metu ląstelėse vykstantys pokyčiai.

"HaCaT ląstelėms atliktas įbrėžimo tyrimas": Šiame vaizdo įraše demonstruojamas su HaCaT ląstelėmis atliekamas įbrėžimo tyrimas. Įbrėžimo bandymas yra plačiai naudojamas metodas ląstelių migracijai tirti, o šiuo atveju jis naudojamas HaCaT ląstelių migracijai analizuoti. Vaizdo įraše demonstruojamas įbrėžimo ląstelių kultūros lėkštelės paviršiuje sukūrimo procesas, po to mikroskopu stebima, kaip HaCaT ląstelės migruoja ir laikui bėgant užpildo plyšį.

"HaCaT keratinocitų ląstelių augimas žaizdų gijimo eksperimentams": Šiame vaizdo įraše demonstruojamas HaCaT keratinocitų ląstelių augimo procesas, skirtas žaizdų gijimo eksperimentams. HaCaT keratinocitai yra dažniausiai žaizdų gijimo tyrimuose naudojama ląstelių linija.

"HaCaT ląstelių diferenciacija": Šiame vaizdo įraše rodomi būtini HaCaT ląstelių diferencijavimo etapai. HaCaT ląstelės gali diferencijuotis į įvairių tipų odos ląsteles. Vaizdo įraše demonstruojami HaCaT ląstelių pokyčiai joms diferencijuojantis, vizualiai parodant įvairius diferenciacijos žymenis ir ypatybes. Diferenciacijos procesas yra labai svarbus normaliam odos funkcionavimui, o vaizdo įraše pabrėžiami skirtingi diferenciacijos etapai, kuriuos pereina HaCaT ląstelės.

Nuorodos

1. Angel P ir Karin M: Jun, Fos ir AP-1 komplekso vaidmuo ląstelių proliferacijoje ir transformacijoje. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolation and characterization of a spontaneously arising long-lived line of human keratinocytes (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutacijos žmogaus nemortizuotų epitelinių ląstelių linijose. Kancerogenezė 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutacijų židiniai dėl saulės šviesos nemelanominio odos vėžio p53 gene. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993 m
5. Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in the regenerative basal layer of human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT ląstelės kaip patikimas in vitro diferenciacijos modelis žmogaus keratinocitų uždegiminiam/atstatomajam atsakui ištirti. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line (Normali keratinizacija spontaniškai imortalizuotoje aneuploidinio žmogaus keratinocitų ląstelių linijoje) J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Gibbs, Gibbs, G.: Analysing qualitative data (Kokybinių duomenų analizė). Sage kokybinių tyrimų rinkinys. Londonas: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Applied research design: a practical guide (Taikomųjų tyrimų dizainas: praktinis vadovas). Sage: Londonas
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normalus keratinizavimas spontaniškai imortalizuotoje aneuploidinėje žmogaus keratinocitų ląstelių linijoje. Cell Biol. 1988;106:761-771.