HEK293T ląstelės: transfekcijos tyrimų potencialo išnaudojimas

HEK293T ląstelės yra žmogaus embrioninės inkstų ląstelės, plačiai naudojamos pramoninėje biotechnologijoje, toksikologijoje ir vėžio tyrimuose. Šios nemirtingos ląstelės taip pat naudojamos įvairių terapinių baltymų ir virusų gamybai.

Bendrosios HEK293T ląstelių charakteristikos ir kilmė

Šiame straipsnio skyriuje bus aptariama HEK293T ląstelių linijos kilmė ir bendroji informacija. 

• HEK293T ląstelių linija kilusi iš laboratorijoje kultivuotų pirminių žmogaus embrioninių inkstų ląstelių. Mokslininkai šias ląsteles sukūrė 1970-ųjų pradžioje, transfekuodami embrionines inkstų ląsteles suskaidytų adenoviruso 5 tipo DNR fragmentais. Mokslininkai sukūrė HEK293T ląstelių liniją, į HEK293 ląstelių genomą įterpdami beždžionių viruso 40 (SV40) didįjį T-antigeną. Šis modifikavimas leido mokslininkams lengvai transfekuoti 293 ląsteles ir pritaikyti jas baltymų gamybai bei genų ekspresijos tyrimams [1].
• HEK293T ląstelės turi epitelio tipo morfologiją. Jos yra pailgos ir suplotos formos su aiškia ląstelių riba.
• HEK293T ląstelių skersmuo svyruoja nuo 11 iki 15 µm.
• SV40 didžiojo T antigeno HEK293T ląstelės turi sudėtingą kariotipą. Šios ląstelės yra hipotriploidinės, jose yra 3 kartus mažiau chromosomų nei haploidinėje gametoje, o jų modalusis chromosomų skaičius yra 64.

Kuo skiriasi HEK293T ir HEK293?

Tiek HEK293, tiek HEK293T ląstelių linijos yra žmogaus kilmės. HEK293T yra populiari HEK293 ląstelių linijos atmaina. Mokslininkai sukūrė šias ląsteles iš originalių žmogaus embrioninių inkstų 293 ląstelių, transfekuodami jas SV40 didžiojo T antigeno, o nemirtingas HEK293 ląsteles sukūrė transformuodami ir kultivuodami žmogaus embrionines inkstų ląsteles su suskaidytomis žmogaus adenoviruso 5 DNR fragmentais.

Ląstelių technologijos ir HEK293T ląstelių taikymas biomedicinoje

Ląstelių kultūra ir bankas HEK293T tyrimuose

HEK293T ląstelės, gautos iš žmogaus embrioninių inkstų 293 ląstelių, plačiai naudojamos ląstelių kultūroje dėl savo spartaus augimo ir lengvos transfekcijos. Norėdami dirbti su šiomis ląstelėmis, mokslininkai privalo teikti pirmenybę ląstelių bankams, o tai reiškia ląstelių saugojimą ilgalaikiams tyrimams ir terapiniam naudojimui. Jie turi taikyti laipsnišką ląstelių bankavimo metodą, kad išsaugotų ląstelių savybes ir užtikrintų ilgalaikį ląstelių gyvybingumą. Ląstelių bankų kūrimas reikalauja laikytis geros gamybos praktikos taisyklių, kad būtų užtikrintas ląstelių gyvybingumas ir vientisumas terapiniam naudojimui.

Gera gamybos praktika yra labai svarbi kuriant HEK293T ląstelių bankus, kurie yra pagrindas tiek moksliniams tyrimams, tiek terapiniam pritaikymui. Pagrindinis ląstelių bankas tarnauja kaip atskaitos taškas visiems vėlesniems ląstelių produktams. Šių ląstelių gamyba terapiniam pritaikymui, pavyzdžiui, lentivirusų gamyba genų terapijai, vyksta laikantis griežtų reguliavimo standartų, siekiant užtikrinti galutinių produktų saugumą ir veiksmingumą.

Protokolai ir tyrimai naudojant HEK293T

Citotechnologijoje yra sukurti specialūs protokolai ir tyrimai, skirti HEK293T ląstelių savybėms įvertinti. Tai apima genų terapijos vektorių veiksmingumo ir ląstelių sąveikos su ekstraląsteline matrica lėkštelėje arba suspensijos kultūroje vertinimą. Siekiant išlaikyti HEK293T ląstelių vientisumą, mokslininkai tiksliai parenka transfekcijai skirtus reagentus ir žaliavas tikrina pagal griežtus kokybės kontrolės reikalavimus.

HEK293T ląstelių linijos taikymas moksliniuose tyrimuose

• Vakcinų kūrimas: HEK293T ląstelių linija buvo naudojama virusams tirti ir virusinių vektorių pagrindu sukurtoms vakcinoms gaminti, skirtoms kovoti su įvairiomis virusinėmis infekcijomis. Viename tyrime ši embrioninių inkstų ląstelių linija buvo naudojama COVID-19 viruso patekimo į ląsteles per žmogaus angiotenzino konvertuojančio fermento 2 (ACE2) struktūriniams ir funkciniams pagrindams tirti [3]. Be to, neseniai atliktame tyrime HEK93T ląstelės buvo naudojamos SARS-CoV-2 spike pseudotipinių lentivirusų dalelių gamybai [4].
  
• Toksikologiniai tyrimai: ši žmogaus embrioninių inkstų ląstelių linija plačiai naudojama vaistų toksiškumui ir veiksmingumui tirti. 2022 m. atliktuose tyrimuose HEK293T buvo naudojama kaip normali žmogaus ląstelių linija, siekiant patvirtinti Caladium lindenii ekstraktų citotoksinį potencialą prieš kepenų vėžio ląstelių liniją HepG2 [5].
• Genų ekspresijos tyrimai: SV40 didžiojo T antigeno HEK293T ląstelių linija yra labai pritaikyta transfekcijai, todėl tinka genų ekspresijos tyrimams. Viename tyrime HEK293T ląstelės buvo naudojamos ilgos nekoduojančios RNR SNHG16 vaidmeniui reguliuojant trofoblastų funkcijas tirti. Tyrimas parodė, kad LncRNA SNHG16 sąveikauja su miR-218-5p/LASP1 ašimi, kad tarpininkautų šiems poveikiams [6].

Ląstelių terapijos naujovės naudojant HEK293T ląsteles

Ląstelių terapijos pažanga naudojant HEK293T

HEK293T ląstelės labai prisideda prie ląstelių terapijos plėtros, ypač kuriant virusinius vektorius genų terapijai. Šios ląstelės yra būtinos gamybos procesuose, kurie atitinka geros gamybos praktikos reikalavimus, nes jos užtikrina aukštos kokybės genų terapijos produktų gamybą. Gamybos personalo mokymai taip pat orientuoti į HEK293T ląstelių unikalių savybių tvarkymą ir aukštų standartų išlaikymą vaistiniams preparatams, gautiems iš šių ląstelių.

HEK293T ląstelės klinikiniuose tyrimuose ir genų terapijoje

HEK293T ląstelių linija atlieka lemiamą vaidmenį kuriant genų terapijos produktus ir yra neatsiejama klinikinių tyrimų, kurių tikslas – pateikti naujas ląstelių terapijas į rinką, dalis. Tai apima ląstelių linijos aukšto transfektyvumo panaudojimą genų perdavimui, naudojant vektorius, pvz., lentivirusinius pakavimo vektorius, kur integrazės D64V mutacija buvo reikšmingas žingsnis saugumo didinimo link.

Naujoviškos HEK293T ląstelių kultūros technikos

HEK293T ląstelių universalumas leidžia taikyti novatoriškas technikas tiek dvimatėse, tiek sudėtingesnėse ląstelių kultūrose. Šis prisitaikymas yra svarbus tyrinėjant ląstelių produktus įvairių tipų biomedicininiams tyrimams, įskaitant vėžio tyrimus, kur šios ląstelės naudojamos navikų susidarymo procesų tyrimams ir vaistų bandymams. Be to, HEK293T linija yra labai svarbi gaminant lentivirusines daleles, kurios yra kritiškai svarbios tiek moksliniams tyrimams, tiek terapinių vektorių gamybos procesams.

Įsigykite HEK293 ląsteles savo tyrimams

Pagerinkite savo tyrimus naudodami mūsų HEK293 ląsteles, kurios garsėja savo pritaikomumu genų ekspresijos tyrimuose ir vakcinų gamyboje. Mūsų pasiūlymuose yra įvairių variantų, pavyzdžiui, HEK293T, HEK293 suspensijai pritaikyta linija, HEK293T/17, AAV-293 ir 2V6.11. Susipažinkite su mūsų plačiu asortimentu, kuris padės jums vykdyti ir tobulinti eksperimentinius darbus.

HEK293T ląstelių linijos auginimo informacija

HEK293T ląstelės plačiai kultivuojamos mokslinių tyrimų laboratorijose. Prieš pradedant HEK293T ląstelių kultūrą, turite žinoti: koks yra HEK293T ląstelių dvigubėjimo laikas? Kas yra HEK293T terpė? Koks yra HEK293T sėjimo tankis?

Svarbiausi HEK293T ląstelių auginimo aspektai

Padvigubėjimo laikas:

HEK293T ląstelių dauginimosi laikas yra 30 valandų.

Adhezyvinės ar suspensinės:

HEK293T yra adhezyvinė ląstelių linija.

Sėjimo tankis:

HEK293T ląstelės sėjamos 1 x 10⁴ ląstelių/cm² tankumu. Esant šiam sėjos tankumui, ląstelės gali suformuoti konfluentinį monosluoksnį per maždaug 4 dienas. Sėjai adhezinės ląstelės atskiriamos naudojant „Accutase“ disociacijos tirpalą. Atsiskyrusios ląstelės centrifuguojamos, o tada atsargiai resuspenduojamos naudojant auginimo terpę. Po to ląstelės išpilamos į naujas kolbas kultivavimui.

Augimo terpė:

HEK293T ląstelės auginamos EMEM (Eagle's minimal essential medium) terpėje, kurioje yra 1,0 g/l L-gliukozės, 2,2 g/l NaHCO3, 2,0 mM L-glutamino ir 10 % veršelių serumo. Terpę reikia keisti du kartus per savaitę.

Auginimo sąlygos:

HEK293T ląstelių kultūros laikomos 37 °C drėgname inkubatoriuje su 5 % CO2 tiekimu.

Laikymas:

Žmogaus embrioninės inkstų HEK293T ląstelės laikomos skysto azoto garų fazėje arba ilgiau – temperatūroje, žemesnėje nei -150 °C.

Užšaldymo procesas ir terpė:

HEK293 ląstelės gali būti užšaldomos CM-1 arba CM-ACF užšaldymo terpėse. Siekiant išsaugoti HEK293T ląstelių gyvybingumą, rekomenduojami lėto užšaldymo procesai, leidžiantys temperatūrai palaipsniui kristi 1 °C.

Atšildymo procesas:

Užšaldytas ląstelių buteliukas greitai maišomas vandens vonioje (37 °C), kol lieka tik nedidelis ledo gabalėlis. Ląstelės vėl suspenduojamos terpėje ir centrifuguojamos, kad būtų pašalinti užšaldymo terpės komponentai. Atgaivintos ląstelės tada kultivuojamos naujose kolbose, kuriose yra auginimo terpė. 

Biologinio saugumo lygis:

HEK293T ląstelių kultūroms tvarkyti ir prižiūrėti reikalinga 1 biologinio saugumo lygio laboratorija.

Dažniausiai užduodami klausimai apie HEK293T ląstelių kultūrą ir programas

HEK293T ląstelės: moksliniai straipsniai

Šiame skyriuje paminėjome keletą perspektyvių mokslinių publikacijų, kuriose aptariamos HEK293T ląstelės.

SARS-CoV-2 mRNS vakcinų, koduojančių N-terminalinį ir receptorių rišimosi domenus, kūrimas

Šis straipsnis bus paskelbtas „BioRxiv“ 2022 m. Šiame tyrime HEK293T ląstelės buvo naudojamos COVID-19 viruso mRNR vakcinų, koduojančių spike geno N-terminalinį ir RBD (receptorių jungimosi sritį) domenus, kūrimui.

Cirkuliuojantis HER2 RNR teigiamas trigubai neigiamas krūties vėžys yra jautrus pertuzumabui

Šis tyrimas paskelbtas žurnale „Molecular Cancer“ 2020 m. Tyrime teigiama, kad cirkuliuojančio HER2 RNR ekspresija trigubai neigiamose krūties vėžio ląstelėse daro jas jautrias gydymui vaistu pertuzumabu. Šiame tyrime mokslininkai naudojo HEK293 ląsteles lentivirusų gamybai ir cirkuliuojančio HER2 geno transfekcijai.

IFITM3 antivirusinis vaidmuo prototipinio putplasčio viruso infekcijoje

Šis straipsnis buvo paskelbtas žurnale „Virology Journal“ 2022 m. Šiame tyrime buvo naudojamos HEK293T ląstelės, siekiant ištirti IFITM3 (interferono indukuoto transmembraninio baltymo 3) antivirusinį poveikį prototipinio putinio viruso (PFV) infekcijoje.

MiRNA-21 tarpininkauja metformino antiangiogeniniam aktyvumui, veikdamas PTEN ir SMAD7 ekspresiją bei PI3K/AKT signalinį kelią

Šiame moksliniame straipsnyje, paskelbtame žurnale „Nature Scientific Reports“ (2017 m.), buvo naudojamos HEK293T ląstelės ir tirta, kaip miRNA-21 tarpininkauja metformino sukeltam antiangiogeniniam poveikiui, reguliuodamas PI3K/AKT signalinį kelią bei SMAD7 ir PTEN genų ekspresiją.

MikroRNR-608 slopina šlapimo pūslės vėžio proliferaciją per AKT/FOXO3a signalinį kelią

Šis tyrimas buvo paskelbtas žurnale „Molecular Cancer“ 2017 m. Šiame tyrime buvo naudojamos HEK293 ląstelės, siekiant ištirti miRNA-608 antiproliferacinį potencialą prieš šlapimo pūslės vėžį.

Ištekliai, susiję su HEK293T ląstelių linija: protokolai, vaizdo įrašai ir kita

Toliau pateikiami keli ištekliai apie HEK293T ląsteles:

• HEK293T ląstelių transfekcija.
• HEK ląstelių transfekcija: šiame vaizdo įraše parodomas bendras žmogaus embrioninių inkstų ląstelių linijos HEK293 transfekcijos protokolas.
• Ląstelių perėjimas: šiame vaizdo įraše paaiškinama adhezyvinių ląstelių dalijimo arba subkultivavimo procedūra.

Ląstelių kultūros protokolai

Čia pateikiami HEK293T ląstelių kultivavimo protokolai.

• HEK293T ląstelių dalijimas: Šioje svetainėje pateikiamas išsamus žingsnis po žingsnio HEK293 ląstelių subkultūravimo vadovas.
• Žmogaus embrioninių inkstų ląstelių kultivavimas: Ši nuoroda pateiks HEK293T ląstelių kultivavimo protokolą.

Nuorodos

1. Tan, E., et al., HEK293 ląstelių linija kaip platforma rekombinantinių baltymų ir virusinių vektorių gamybai. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9.
2. Kim, M.J. ir kt., „AMPKα1 reguliuoja plaučių ir krūties vėžio progresavimą, reguliuodamas TLR4 tarpininkaujamą TRAF6-BECN1 signalizacijos ašį“. Cancers (Basel), 2020, 12(11).
3. Wang, Q. ir kt., SARS-CoV-2 patekimo į ląsteles naudojant žmogaus ACE2 struktūrinis ir funkcinis pagrindas. Cell, 2020. 181(4): p. 894–904.
4. Gale, E.C., et al., Hidrogelio pagrindu lėtai išsiskirianti receptorių jungiančio domeno subvieneto vakcina sukelia neutralizuojančių antikūnų atsaką prieš SARS-CoV-2. bioRxiv, 2021.
5. Kalsoom, A., et al., In vitro vertinimas Caladium lindenii ekstraktų citotoksinio potencialo žmogaus hepatokarcinomos HepG2 ir normaliose HEK293T ląstelių linijose. Biomed Res Int, 2022, p. 1279961.
6. Yu, Z., et al., LncRNA SNHG16 reguliuoja trofoblastų funkcijas per miR-218-5p/LASP1 ašį. J Mol Histol, 2021. 52(5): p. 1021-1033.