Cellules primaires humaines

Que sont les cellules primaires humaines ?

Les cellules primaires constituent la représentation la plus pure de leurs tissus respectifs. Elles sont isolées du tissu et traitées de manière à pouvoir s'établir dans un milieu de culture offrant des conditions idéales. Elles reproduisent plus fidèlement l'état in vivo et présentent une physiologie normale, car elles sont issues du tissu plutôt que d'avoir été modifiées. De ce fait, elles peuvent servir de modèles utiles pour la recherche en pharmacologie cellulaire, en toxicologie et en physiologie (notamment pour les études sur le métabolisme, le vieillissement et la transduction du signal). Il faut garder à l’esprit que les cellules primaires sont plus difficiles à cultiver et à entretenir qu’une lignée cellulaire continue, car elles ont une durée de vie plus courte et cessent de se diviser (ou sénescent) après un certain nombre de divisions cellulaires. Les études sur les voies de signalisation cellulaire sont compliquées par la variabilité inhérente aux cellules primaires prélevées sur des donneurs et par les pratiques de sous-culture. Avant de commencer des études sur la signalisation, les chercheurs procèdent souvent à un criblage afin de déterminer si les cellules répondent ou non aux stimuli couramment utilisés. Pour éviter de perdre du temps et de l’argent, les cellules primaires peuvent être stimulées afin d’activer les principales voies de signalisation avant d’être criblées.

Pourquoi utiliser des cellules primaires humaines ?

Les lignées cellulaires immortalisées sont couramment utilisées comme modèle cellulaire. Cependant, les scientifiques reconnaissent que les modifications biologiques induites par ces lignées peuvent nuire à l’étude de leur signification physiologique. L’utilisation de cellules primaires humaines améliore la valeur physiologique des données obtenues par culture cellulaire, et celles-ci sont de plus en plus considérées comme essentielles pour l’étude des processus biologiques, de l’évolution des maladies et du développement de médicaments.

Les cellules primaires humaines sont largement utilisées dans les études in vitro portant sur la communication intercellulaire et intracellulaire, la biologie du développement, ainsi que les mécanismes sous-jacents au cancer, à la maladie de Parkinson et au diabète, parmi de nombreux autres domaines de recherche biologique préclinique et fondamentale. Les chercheurs utilisent depuis longtemps des lignées cellulaires immortalisées pour étudier le fonctionnement des tissus ; cependant, les lignées cellulaires présentant des mutations évidentes et des anomalies chromosomiques peuvent ne pas constituer de bons substituts aux cellules normales ni refléter fidèlement le développement d’une maladie à ses stades précoces. Il est désormais possible d’obtenir un modèle plus précis d’un type cellulaire tissulaire spécifique en utilisant des cellules primaires humaines isolées à partir de ce tissu et maintenues dans des milieux de culture de cellules primaires et des compléments.

Qu’est-ce qu’une culture de cellules primaires ?

Au lieu d’utiliser des lignées cellulaires immortalisées, la culture de cellules primaires consiste à cultiver des cellules provenant directement d’un organisme multicellulaire en dehors du corps. Certains pays, comme le Royaume-Uni, reconnaissent légalement que les cultures de cellules primaires sont plus représentatives des tissus in vivo que les lignées cellulaires. Néanmoins, les cellules primaires ont besoin d’un substrat et de nutriments adaptés pour se développer, et après un certain nombre de divisions, elles développent un phénotype sénescent qui les empêche définitivement de se diviser. Ces deux facteurs motivent la création de lignées cellulaires. Tant les cellules primaires immortalisées naturellement (par exemple, les cellules HeLa) que celles immortalisées artificiellement (par exemple, les cellules HEK) peuvent être cultivées indéfiniment en culture cellulaire.

Cellules primaires humaines par type de tissu

Les cellules épithéliales, les fibroblastes, les kératinocytes, les mélanocytes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires, les cellules immunitaires et les cellules souches, telles que les cellules souches mésenchymateuses, comptent parmi les cellules primaires humaines les plus couramment utilisées dans la recherche scientifique. Au départ, les cultures sont hétérogènes (représentant un mélange des types cellulaires présents dans le tissu) et ne peuvent être maintenues en vie in vitro que pendant une durée déterminée. La transformation est un processus in vitro qui permet de manipuler les cellules primaires humaines afin de réaliser des sous-cultures illimitées. La transformation peut se produire naturellement ou être induite par des produits chimiques ou des virus. Après avoir subi une transformation génétique, une culture primaire peut se diviser indéfiniment pour donner naissance à une lignée cellulaire secondaire immortalisée, à condition de disposer de nutriments et d’espace en quantité suffisante.

Cellules endothéliales

Le traitement du cancer, la cicatrisation des plaies, la recherche sur la signalisation cellulaire, le criblage à haut débit et à haut contenu, ainsi que le criblage toxicologique ne sont que quelques-uns des domaines pouvant bénéficier de l’utilisation de cellules endothéliales primaires comme outil de recherche.

Kératinocytes

Les kératinocytes, issus de l’épiderme de la peau humaine adulte ou du prépuce néonatal, jouent un rôle crucial dans l’étude des maladies cutanées telles que le psoriasis et le cancer.

Cellules épithéliales

Des études sur le cancer aux analyses toxicologiques, les cellules épithéliales primaires se sont révélées être des ressources inestimables pour modéliser les défenses naturelles de l'organisme.

Fibroblastes

L'induction de cellules souches pluripotentes (iPS) et l'étude de la cicatrisation ne sont que quelques-unes des nombreuses applications des fibroblastes primaires.

Cellules immunitaires

Les cellules mononucléaires du sang périphérique, ou PBMC, sont des cellules mononucléaires du sang dotées d’un noyau rond. Elles comprennent principalement des lymphocytes et des monocytes, qui jouent un rôle important au cours d’une réponse immunitaire. Les cellules mononucléaires du sang périphérique sont souvent utilisées pour diagnostiquer des infections ou pour détecter une éventuelle protection vaccinale. Il est souvent crucial de bien comprendre la réponse immunitaire cellulaire médiée par les lymphocytes T.

Mélanocytes

Les mélanocytes, cellules cutanées spécialisées produisant le pigment mélanine, constituent des modèles utiles pour la recherche sur des thèmes tels que la cicatrisation des plaies, la toxicité, le mélanome, la réponse dermique aux rayons ultraviolets (UV), les maladies de la peau et les cosmétiques.

Cellules souches

Les cellules souches ont le potentiel de se différencier en une grande variété de types cellulaires. Grâce à leur capacité de différenciation, elles offrent de nouvelles possibilités pour la modélisation des tissus humains et des pathologies.

Cellules souches mésenchymateuses

Les cellules souches mésenchymateuses, également appelées CSM, peuvent être prélevées à partir de différentes sources humaines telles que la moelle osseuse, la graisse (tissu adipeux), le tissu du cordon ombilical (gelée de Wharton) et le liquide amniotique (liquide entourant le fœtus) ; elles peuvent être cultivées in vitro. Ces cellules souches stromales adultes ont la capacité de se développer en une grande variété de types cellulaires. Parmi ces types cellulaires figurent notamment les cellules osseuses, les cellules cartilagineuses, les cellules musculaires, les cellules nerveuses, les cellules cutanées et les cellules cornéennes.

Cellules musculaires lisses

Au sein des organes creux, les cellules musculaires lisses (CML) primaires tapissent la paroi interne et assurent la contractilité. Outre le cancer et d’autres maladies, les CML peuvent être utilisées pour modéliser la fibrose liée à l’hypertension.

Cellules primaires et lignées cellulaires

Que ce soit par mutation spontanée, comme dans les lignées cellulaires cancéreuses transformées, ou par altération intentionnelle, comme dans la production artificielle de gènes cancéreux, les lignées cellulaires continues ont acquis la capacité de se reproduire à l’infini (immortalisées). En règle générale, les lignées cellulaires continues sont plus fiables et plus pratiques à manipuler que les cellules primaires. Elles peuvent se multiplier indéfiniment et permettent d’accéder rapidement à des données essentielles. L’utilisation de lignées cellulaires continues présente certaines limites, notamment le fait qu’elles soient génétiquement modifiées/transformées, ce qui peut altérer leurs caractéristiques physiologiques et les rendre non conformes aux conditions in vivo, et que ces caractéristiques puissent encore évoluer au fil du temps en raison d’un nombre important de passages.

Progrès en matière de culture de cellules primaires

Les cellules primaires ont la réputation notoire d’être difficiles à manipuler. Le processus devient toutefois plus simple que jamais grâce aux progrès de la culture de cellules primaires, à la disponibilité de cellules primaires commerciales accompagnées de protocoles entièrement optimisés, et à de nouvelles techniques d’analyse nécessitant moins d’efforts.

Le passage de la culture cellulaire bidimensionnelle à la culture tridimensionnelle est considéré comme une avancée majeure dans ce domaine. L’architecture spécifique au tissu, les interactions intercellulaires et la signalisation mécanique/biochimique peuvent être atténuées dans une culture 2D. La valeur biologique de ces cultures atteint donc une limite.

En revanche, la culture cellulaire en 3D permet aux cellules de se multiplier et d’interagir avec une matrice extracellulaire tridimensionnelle. Cela permet aux cellules d’interagir entre elles et avec la matrice extracellulaire, ce qui rend les cultures en 3D plus pertinentes sur le plan physiologique. La précision de cette méthode pour prédire les réponses in vivo en a fait une révolution dans des domaines tels que la découverte et le développement de médicaments. C’est pourquoi des technologies de pointe, telles que les organoïdes dérivés de patients et les « organes sur puce », fournissent des modèles hautement contextuels pour le criblage et le développement de médicaments.

La génération de cellules primaires constitue un goulot d’étranglement dans la culture primaire. Un volume de tissu plus important est généralement nécessaire pour surmonter cet obstacle, ce qui peut s’avérer difficile à obtenir. Cependant, l’amélioration de la sensibilité analytique ouvre de nouvelles perspectives. Par exemple, le recours à la technologie unicellulaire, qui inclut le séquençage, le western blot et la cytométrie de masse, permet de réduire la nécessité de cultiver de grandes quantités de cellules primaires.

Des perspectives prometteuses pour la culture de cellules primaires

Les difficultés générales liées à la culture de cellules primaires sont atténuées par les avancées technologiques. En conséquence, cette méthode remplace rapidement les autres pour s’imposer comme la référence en matière d’études et de pratiques en biologie cellulaire et moléculaire. La fabrication de vaccins, la greffe d’organes, les thérapies à base de cellules souches, la recherche sur le cancer et bien d’autres domaines devraient grandement bénéficier des progrès continus réalisés dans le domaine de la culture de cellules primaires.

Conseils et astuces pour la culture de cellules primaires

Les besoins liés à la multiplication cellulaire

Les deux méthodes les plus courantes de culture des cellules primaires sont la culture en suspension ou sur une surface (2D). Certaines cellules sont capables de flotter librement dans la circulation sanguine sans jamais adhérer à une surface (par exemple celles issues du sang périphérique). Différentes lignées cellulaires ont été conçues pour se développer dans des cultures en suspension, où elles peuvent atteindre des densités inaccessibles dans des conditions de croissance 2D. Les cellules primaires qui ont besoin d’un ancrage pour se développer in vitro sont appelées cellules adhérentes et comprennent celles que l’on trouve dans les tissus solides. Afin d’améliorer leurs propriétés d’adhérence et de leur fournir d’autres signaux nécessaires à leur croissance et à leur différenciation, ces cellules sont généralement cultivées dans un récipient plat en plastique non enduit, mais parfois sur un micro-support. Ce dernier peut être enduit de protéines de la matrice extracellulaire (telles que le collagène et la laminine). Les milieux utilisés en culture cellulaire se composent d’un milieu de base enrichi des facteurs de croissance et des cytokines appropriés. Un incubateur cellulaire est un type particulier d’incubateur de laboratoire utilisé pour cultiver et maintenir des cellules à une température et dans un mélange gazeux spécifiques (généralement 37 °C, 5 % de CO₂ pour les cellules mammifères). Selon le type de cellules cultivées, les conditions optimales peuvent varier considérablement. En fonction des types de cellules cultivées, le milieu de croissance optimal présentera une combinaison unique de facteurs, comprenant notamment, mais sans s’y limiter, le pH, la concentration en glucose, les facteurs de croissance et la présence d’autres nutriments.

La présence d’antibiotiques dans le milieu de culture est essentielle lors de la mise en place d’une culture primaire afin de prévenir toute contamination provenant du tissu hôte. Certains schémas antibiotiques associent la gentamicine, la pénicilline, la streptomycine et l’amphotéricine B. L’utilisation d’antibiotiques sur une longue période n’est toutefois pas recommandée, car certains réactifs (tels que l’amphotéricine B) peuvent s’avérer toxiques pour les cellules à long terme.

La plupart des cellules primaires subissent un processus de sénescence et cessent de se diviser après un certain nombre de doublements de population, d’où l’importance cruciale de les maintenir en vie après leur isolement. La viabilité cellulaire à long terme nécessite des techniques de culture cellulaire spécialisées et des conditions de culture idéales (notamment un milieu approprié, une température adéquate, un mélange gazeux adapté, un pH correct, une concentration adéquate en facteurs de croissance, la présence de nutriments et la présence de glucose). Étant donné que bon nombre des facteurs de croissance utilisés pour enrichir les milieux de culture sont issus du sang animal (les composants dérivés du sang présentant un risque de contamination), il est recommandé d’en limiter l’utilisation au strict minimum, voire de les éviter complètement. Il est également important d’utiliser une technique aseptique.

Sous-culture et entretien

Lorsque les cellules isolées adhèrent à la surface de la boîte de culture, cela marque le début de la phase d’entretien. L’adhérence se produit généralement 24 heures après le début de la culture. Les cellules doivent être repiquées lorsqu’elles ont atteint un certain pourcentage de confluence et qu’elles se multiplient activement. Étant donné que les cellules post-confluentes peuvent subir une différenciation et présenter une prolifération plus lente après passage, il est préférable de repiquer les cultures de cellules primaires avant qu’elles n’atteignent 100 % de confluence.

La repiquage dans un milieu frais permet de maintenir la croissance exponentielle des cellules dépendantes de l’ancrage. Le repiquage des monocouches perturbe les interactions intercellulaires et intracellulaires à la surface cellulaire. De faibles concentrations d’enzymes protéolytiques, telles que la trypsine/EDTA, sont utilisées pour extraire les cellules primaires adhérentes des monocouches ou des tissus. Une fois dissociées et diluées en une solution de cellules individuelles, les cellules sont comptées puis transférées dans des récipients de culture neufs afin de se réadherer et de se multiplier.

Cryoconservation et réactivation

La cryoconservation permet de préserver les cellules vivantes en les congelant à basse température. La cryoconservation et la décongélation des cellules primaires humaines empêchent la mort cellulaire et les dommages pendant le stockage et l’utilisation. Les cellules primaires humaines sont cryoprotégées à l’aide de DMSO ou de glycérol (à la bonne température et avec une vitesse de congélation contrôlée). Le processus de congélation doit être progressif, à raison de -1 °C par minute, afin d’empêcher la formation de cristaux de glace. La conservation à long terme nécessite de l’azote liquide (-196 °C) ou des températures inférieures à -130 °C.

Il suffit de plonger les cellules congelées dans un bain-marie à 37 °C pendant environ 1 à 2 minutes pour décongeler les cellules cryoconservées. Les cellules primaires humaines ne doivent pas être centrifugées après leur sortie du congélateur (car elles sont extrêmement sensibles aux dommages lors de la récupération après cryoconservation). Ce milieu convient à la mise en culture des cellules immédiatement après la décongélation et favorise leur adhérence au cours des 24 premières heures suivant la mise en culture. 1 Une fois que les cellules primaires cryoconservées se sont fixées, le milieu usagé doit être éliminé (car le DMSO est nocif pour les cellules primaires et peut entraîner une baisse de la viabilité après décongélation).