Cellules primaires humaines

Qu'est-ce qu'une cellule primaire humaine ?

Les cellules primaires sont la représentation la plus pure de leurs tissus respectifs. Elles sont isolées du tissu et traitées de manière à ce qu'elles puissent s'établir dans un environnement de culture aux conditions idéales. Elles imitent plus fidèlement l'état in vivo et présentent une physiologie normale parce qu'elles sont dérivées du tissu plutôt que modifiées. Elles peuvent donc servir de modèles utiles pour la recherche en pharmacologie cellulaire, en toxicologie et en physiologie (y compris les études sur le métabolisme, le vieillissement et la transduction des signaux). Il faut garder à l'esprit que les cellules primaires sont plus difficiles à cultiver et à entretenir qu'une lignée cellulaire continue, car elles ont une durée de vie plus courte et cessent de se diviser (ou sénescence) après un certain nombre de divisions cellulaires. Les études sur les voies de signalisation cellulaire sont compliquées par la variabilité inhérente aux cellules primaires acquises auprès de donneurs et par les pratiques de sous-culture. Avant de commencer les études de signalisation, les chercheurs effectuent souvent un criblage pour déterminer si les cellules répondent ou non aux stimuli couramment utilisés. Pour éviter de perdre du temps et de l'argent, les cellules primaires peuvent être stimulées pour activer les principales voies de signalisation avant d'être criblées.

Pourquoi utiliser des cellules primaires humaines ?

Les lignées cellulaires immortalisées sont couramment utilisées comme test cellulaire. Bien que les scientifiques aient reconnu que les modifications biologiques dues aux lignées cellulaires peuvent être préjudiciables à l'étude de leur signification physiologique. L'utilisation de cellules primaires humaines améliore la valeur physiologique des données obtenues à partir de cultures cellulaires, et elles sont de plus en plus considérées comme importantes pour l'étude des processus biologiques, l'évolution des maladies et le développement de médicaments.

Les cellules primaires humaines sont largement utilisées dans les études in vitro sur la communication intercellulaire et intracellulaire, la biologie du développement et les mécanismes sous-jacents au cancer, à la maladie de Parkinson et au diabète, parmi de nombreux autres domaines de recherche biologique préclinique et expérimentale. Les chercheurs utilisent depuis longtemps des lignées cellulaires immortalisées pour étudier le fonctionnement des tissus ; cependant, les lignées cellulaires présentant des mutations et des anomalies chromosomiques évidentes peuvent ne pas être de bons substituts pour les cellules normales et le développement d'une maladie à ses premiers stades. Il est désormais possible d'obtenir un modèle plus précis d'un type de cellule tissulaire spécifique en utilisant des cellules primaires humaines isolées de ce tissu et maintenues dans des milieux de culture de cellules primaires et des suppléments.

Qu'est-ce que la culture de cellules primaires ?

Au lieu d'utiliser des lignées cellulaires immortalisées, la culture de cellules primaires consiste à cultiver des cellules directement à partir d'un organisme multicellulaire en dehors du corps. Certains pays, comme le Royaume-Uni, reconnaissent légalement que les cultures de cellules primaires sont plus représentatives des tissus in vivo que les lignées cellulaires. Néanmoins, les cellules primaires ont besoin d'un substrat et de nutriments adéquats pour se développer et, après un certain nombre de divisions, elles développent un phénotype sénescent qui les amène à cesser définitivement de se diviser. Ces deux facteurs motivent la création de lignées cellulaires. Les cellules primaires naturellement immortalisées (par exemple, les cellules HeLa) et les cellules primaires artificiellement immortalisées (par exemple, les cellules HEK) peuvent être cultivées indéfiniment en culture cellulaire.

Cellules primaires humaines par type de tissu

Les cellules épithéliales, les fibroblastes, les kératinocytes, les mélanocytes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires, les cellules immunitaires et les cellules souches comme les cellules souches mésenchymateuses sont parmi les cellules primaires humaines les plus couramment utilisées dans les études scientifiques. Pour commencer, les cultures sont hétérogènes (elles représentent un mélange de types de cellules présentes dans le tissu) et elles ne peuvent être maintenues en vie in vitro que pendant une durée déterminée. La transformation est un processus in vitro qui permet de manipuler des cellules primaires humaines pour un nombre illimité de sous-cultures. La transformation peut se produire naturellement ou être induite par des produits chimiques ou des virus. Après avoir subi une transformation génétique, une culture primaire peut se diviser indéfiniment en une lignée cellulaire secondaire immortalisée si elle dispose de suffisamment de nutriments et d'espace.

Cellules endothéliales

Le traitement du cancer, la cicatrisation des plaies, la recherche sur la signalisation cellulaire, le criblage à haut débit et à haut contenu, et le criblage toxicologique ne sont que quelques-uns des domaines qui peuvent bénéficier de l'utilisation des cellules endothéliales primaires en tant qu'outil de recherche.

Kératinocytes

Les kératinocytes, dérivés de l'épiderme de la peau humaine adulte ou du prépuce néonatal, jouent un rôle crucial dans l'étude des maladies de la peau telles que le psoriasis et le cancer.

Cellules épithéliales

Des études sur le cancer aux recherches toxicologiques, les cellules épithéliales primaires se sont révélées être des ressources inestimables pour modéliser les défenses naturelles de l'organisme.

Fibroblastes

L'induction de cellules souches pluripotentes (iPS) et l'étude de la cicatrisation ne sont que quelques-unes des nombreuses utilisations des fibroblastes primaires.

Cellules immunitaires

Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont des cellules mononucléaires du sang dont le noyau est rond. Elles comprennent principalement des lymphocytes et des monocytes, qui assument des fonctions importantes au cours d'une réponse immunitaire. Les cellules mononucléaires du sang périphérique sont souvent utilisées pour diagnostiquer des infections ou pour détecter une éventuelle protection vaccinale. La compréhension de la réponse immunitaire cellulaire médiée par les cellules T est souvent cruciale.

Mélanocytes

Les mélanocytes, cellules spécialisées de la peau qui produisent le pigment mélanine, sont utiles comme modèles pour la recherche sur des sujets tels que la cicatrisation, la toxicité, le mélanome, la réponse dermique au rayonnement ultraviolet (UV), les maladies de la peau et les cosmétiques.

Les cellules souches

Les cellules souches ont la capacité de se différencier en une grande variété de types de cellules. Grâce à leur capacité de différenciation, elles offrent de nouvelles possibilités de modélisation des tissus humains et des états de santé.

Cellules souches mésenchymateuses

Les cellules souches mésenchymateuses, également appelées CSM, peuvent être obtenues à partir de différentes sources humaines telles que la moelle osseuse, la graisse (tissu adipeux), le tissu du cordon ombilical (gelée de Wharton) et le liquide amniotique (le liquide qui entoure le fœtus) et peuvent être multipliées in vitro. Ces cellules souches stromales adultes ont la capacité de se transformer en une grande variété de types de cellules. Parmi ces types de cellules figurent les cellules osseuses, les cellules cartilagineuses, les cellules musculaires, les cellules neurales, les cellules de la peau et les cellules de la cornée.

Cellules musculaires lisses

Dans les organes creux, les cellules musculaires lisses (CML) primaires tapissent l'intérieur et assurent la contractilité. Outre le cancer et d'autres maladies, les CML peuvent être utilisées pour modéliser la fibrose de l'hypertension.

Cellules primaires et lignées cellulaires

Que ce soit par mutation spontanée, comme dans les lignées cellulaires cancéreuses transformées, ou par altération intentionnelle, comme dans la production artificielle de gènes cancéreux, les lignées cellulaires continues ont acquis le potentiel de se reproduire à l'infini (immortalisées). En règle générale, les lignées cellulaires continues sont plus fiables et plus pratiques que les cellules primaires. Elles peuvent se développer indéfiniment et permettent un accès rapide aux données essentielles. L'utilisation de lignées cellulaires continues présente certaines limites, notamment le fait qu'elles sont génétiquement modifiées/transformées, ce qui peut modifier les caractéristiques physiologiques et ne pas correspondre à l'état in vivo, et que cela peut encore changer avec le temps en cas de passage important.

Progrès dans la culture de cellules primaires

Les cellules primaires ont la réputation d'être difficiles à manipuler. Cependant, le processus devient plus facile que jamais grâce aux développements de la culture de cellules primaires, à la disponibilité de cellules primaires commerciales avec des protocoles entièrement optimisés et à de nouvelles techniques d'analyse qui nécessitent moins d'intrants.

Le passage de la culture cellulaire bidimensionnelle à la culture cellulaire tridimensionnelle est considéré comme une étape majeure dans ce domaine. L'architecture spécifique des tissus, les interactions cellule-cellule et la signalisation mécanique/ biochimique peuvent être atténuées dans une culture en 2D. La valeur biologique de ces cultures est donc plafonnée.

En revanche, la culture cellulaire en 3D permet aux cellules de se développer et d'interagir avec un cadre extracellulaire en 3D. Les cellules peuvent ainsi interagir entre elles et avec la matrice extracellulaire, ce qui rend les cultures 3D plus pertinentes d'un point de vue physiologique. La précision de cette méthode dans la prédiction des réponses in vivo l'a rendue révolutionnaire dans des domaines tels que la découverte et le développement de médicaments. C'est pourquoi les technologies de pointe, telles que les organoïdes dérivés de patients et les organes sur puce, fournissent des modèles hautement contextuels pour le dépistage et le développement de médicaments.

La génération de cellules primaires est un goulot d'étranglement dans la culture primaire. Pour y remédier, il faut généralement un volume de tissu plus important, ce qui peut s'avérer difficile à obtenir. Toutefois, l'amélioration de la sensibilité analytique permet d'aller de l'avant. Par exemple, la nécessité de cultiver de grandes quantités de cellules primaires est réduite par l'utilisation de la technologie de la cellule unique, qui comprend le séquençage, le western blotting et la cytométrie de masse.

Perspectives prometteuses pour la culture de cellules primaires

Les difficultés générales de la culture de cellules primaires sont atténuées par les progrès technologiques. En conséquence, cette méthode remplace rapidement d'autres méthodes en tant qu'étalon-or dans l'étude et la pratique de la biologie cellulaire et moléculaire. La fabrication de vaccins, le remplacement d'organes, les thérapies à base de cellules souches, la recherche sur le cancer et bien d'autres domaines encore bénéficieront grandement des progrès continus de la culture de cellules primaires.

Conseils et astuces pour la culture de cellules primaires

Les besoins de l'expansion cellulaire

Les deux méthodes les plus courantes pour cultiver des cellules primaires sont la culture en suspension et la culture en surface (2D). Certaines cellules sont capables de flotter librement dans la circulation sanguine sans jamais adhérer à une surface (par exemple celles dérivées du sang périphérique). Différentes lignées cellulaires ont été conçues pour prospérer dans des cultures en suspension, où elles peuvent atteindre des densités impossibles à obtenir dans des conditions de croissance en 2D. Les cellules primaires qui ont besoin d'un ancrage pour se développer in vitro sont appelées cellules adhérentes et comprennent celles que l'on trouve dans les tissus solides. Pour améliorer les propriétés d'adhésion et fournir d'autres signaux nécessaires à la croissance et à la différenciation, ces cellules sont généralement cultivées dans un récipient plat en plastique non revêtu, mais parfois aussi dans un micro-porteur. Ce dernier peut être recouvert de protéines de la matrice extracellulaire (telles que le collagène et la laminine). Le milieu utilisé pour la culture cellulaire est un milieu de base auquel ont été ajoutés les facteurs de croissance et les cytokines appropriés. Un incubateur de cellules est un type spécial d'incubateur de laboratoire utilisé pour cultiver et maintenir les cellules à une température et un mélange de gaz spécifiques (généralement 37 °C, 5 % de CO2 pour les cellules de mammifères). Selon le type de cellule cultivée, les conditions optimales peuvent être très différentes. Selon les types de cellules cultivées, le milieu de croissance optimal présentera une combinaison unique de facteurs, y compris, mais sans s'y limiter, le pH, la concentration en glucose, les facteurs de croissance et la présence d'autres nutriments.

La présence d'antibiotiques dans le milieu de croissance est cruciale lors de l'établissement de la culture primaire afin d'éviter la contamination par le tissu hôte. Certains régimes antibiotiques associent la gentamicine, la pénicilline, la streptomycine et l'amphotéricine B. L'utilisation d'antibiotiques pendant une période prolongée n'est toutefois pas conseillée, car certains réactifs (tels que l'amphotéricine B) peuvent être toxiques pour les cellules à long terme.

La plupart des cellules primaires entrent en sénescence et cessent de se diviser après un certain nombre de doublements de la population, d'où l'importance de les maintenir en vie après l'isolement. La viabilité à long terme des cellules nécessite des techniques de culture cellulaire expertes et des conditions de culture idéales (notamment le bon milieu, la bonne température, le bon mélange de gaz, le bon pH, la bonne concentration de facteurs de croissance, la présence de nutriments et la présence de glucose). Étant donné que de nombreux facteurs de croissance utilisés pour compléter les milieux sont obtenus à partir de sang animal (les ingrédients dérivés du sang présentent un risque de contamination), il est recommandé de minimiser ou d'éviter leur utilisation. Il est également important d'utiliser une technique aseptique.

Sous-culture et entretien

Lorsque les cellules isolées adhèrent à la surface de la boîte de culture, cela marque le début de la phase d'entretien. L'attachement se produit généralement 24 heures après le début de la culture. Les cellules doivent être sous-cultivées lorsqu'elles ont atteint un certain pourcentage de confluence et qu'elles se répliquent activement. Étant donné que les cellules post-confluentes peuvent subir une différenciation et présenter une prolifération plus lente après le passage, il est préférable de repiquer les cultures de cellules primaires avant qu'elles n'atteignent 100 % de confluence.

La sous-culture dans un milieu frais maintient la croissance exponentielle des cellules dépendantes de l'ancrage. La sous-culture des monocouches perturbe les interactions inter- et intracellulaires de la surface des cellules. De faibles concentrations d'enzymes protéolytiques, telles que la trypsine/EDTA, sont utilisées pour extraire les cellules primaires adhérentes des monocouches ou des tissus. Après avoir été dissociées et diluées dans une solution unicellulaire, les cellules sont comptées et transférées dans de nouveaux récipients de culture pour s'attacher à nouveau et se multiplier.

Cryoconservation et récupération

La cryoconservation préserve les cellules vivantes en les congelant à basse température. La cryoconservation et la décongélation des cellules primaires humaines empêchent la mort cellulaire et les dommages pendant le stockage et l'utilisation. Les cellules primaires humaines sont cryoprotégées à l'aide de DMSO ou de glycérol (à la bonne température et avec une vitesse de congélation contrôlée). Le processus de congélation doit être progressif, à raison de -1 °C par minute, afin d'éviter la formation de cristaux de glace. Le stockage à long terme nécessite de l'azote liquide (-196 °C) ou des températures inférieures à -130 °C.

Il suffit de plonger les cellules congelées dans un bain d'eau à 37 °C pendant 1 à 2 minutes pour décongeler les cellules cryoconservées. Les cellules primaires humaines ne doivent pas être centrifugées après leur sortie du congélateur (car elles sont extrêmement sensibles aux dommages pendant la récupération après la cryoconservation). Il convient à l'ensemencement des cellules immédiatement après la décongélation et favorise l'attachement des cultures au cours des 24 premières heures suivant l'ensemencement. 1 Une fois que les cellules primaires cryoconservées se sont fixées, le milieu usé doit être retiré (car le DMSO est nocif pour les cellules primaires et peut entraîner une baisse de la viabilité après décongélation).