Culture de cellules de mammifères : Principes et techniques
La culture de cellules de mammifères est une technique fondamentale de la recherche biologique, qui permet aux scientifiques d'étudier les cellules dans un environnement contrôlé en dehors des organismes vivants. Ce processus consiste à isoler des cellules à partir de tissus, à les maintenir dans des conditions soigneusement contrôlées et à les propager à diverses fins expérimentales. La culture de cellules mammaliennes est essentielle pour comprendre les processus cellulaires, les mécanismes des maladies et développer de nouvelles thérapies, y compris celles qui utilisent des lignées cellulaires immortelles
Principaux enseignements :
- Les cellules peuvent être isolées à partir de tissus par digestion enzymatique ou par culture d'explants
- Les cellules primaires ont une durée de vie limitée, tandis que les lignées cellulaires immortalisées peuvent proliférer indéfiniment
- Les conditions de culture, y compris la composition du milieu de croissance, sont essentielles à la survie et à la prolifération des cellules
- Les cellules peuvent être cultivées en suspension ou en adhérence, selon leur type et les besoins de la recherche
- Les milieux de culture courants comprennent le MEM, le DMEM et le RPMI 1640, chacun étant adapté à des types de cellules spécifiques
- Les conditions de croissance typiques sont une température de 37°C, 5% de CO2 et 95% d'humidité relative
- Les alternatives au sérum, comme le lysat plaquettaire humain (hPL), sont de plus en plus utilisées pour éviter les problèmes de contamination potentiels
Techniques d'isolement cellulaire
Le processus d'établissement d'une culture cellulaire commence par l'isolement des cellules à partir des tissus. Il existe plusieurs méthodes pour y parvenir, chacune adaptée à des types de tissus et à des objectifs de recherche différents. Pour les échantillons de sang, l'isolement des cellules est relativement simple, les globules blancs étant les premiers à être cultivés en raison de leur capacité de croissance. Les tissus solides nécessitent des techniques d'isolement plus complexes. Une méthode courante consiste en une digestion enzymatique, où des enzymes comme la collagénase, la trypsine ou la pronase sont utilisées pour décomposer la matrice extracellulaire, libérant ainsi des cellules individuelles en suspension. Les chercheurs peuvent également utiliser la méthode de culture d'explants, où de petits morceaux de tissu sont placés directement dans un milieu de croissance, permettant aux cellules de migrer et de proliférer. Le choix entre ces méthodes dépend souvent du type de tissu spécifique, de la population cellulaire souhaitée et de l'utilisation expérimentale prévue. Il est important de noter que les cellules isolées directement d'un organisme sont appelées cellules primaires et, à quelques exceptions près comme les cellules dérivées de tumeurs, ont généralement une durée de vie limitée en culture avant de subir une sénescence
Produits essentiels pour la culture de cellules de mammifères
| Nom du produit | Numéro du produit | Catégorie | Application |
|---|---|---|---|
| DMEM, w : 4.5 g/L Glucose, w : 4 mM L-Glutamine, w : 1.5 g/L NaHCO3, w : 1.0 mM Pyruvate de sodium | 820300a | Milieux de culture | Milieu à usage général pour divers types de cellules de mammifères |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w : 3.1 g/L Glucose, w : 1.6 mM L-Glutamine, w : 15 mM HEPES, w : 1.0 mM Pyruvate de sodium, w : 1.2 g/L NaHCO3 | 820400a | Milieux de culture | Convient à une large gamme de cellules de mammifères, en particulier les cellules épithéliales |
| RPMI 1640, w : 2.1 mM Glutamine stable, w : 2.0 g/L NaHCO3 | 820700a | Milieux de culture | Couramment utilisés pour les cellules lymphoïdes et les lignées cellulaires hybrides |
| Accutase | 830100 | Dissociation cellulaire | Solution de détachement cellulaire en douceur pour les cellules adhérentes |
| Milieu de congélation CM-1 | 800150 | Cryopréservation | Pour la congélation et le stockage à long terme des cellules de mammifères |
| Milieu de congélation CM-ACF, sans sérum | 800650 | Cryopréservation | Milieu sans composants animaux pour la congélation de cellules |
| PBS | 860015 | Solution tampon | Pour le lavage des cellules et le maintien de l'équilibre du pH |
| Milieu de croissance des cellules endothéliales | 820731 | Milieu spécialisé | Optimisé pour la culture des cellules endothéliales |
| Test de dépistage des mycoplasmes | 900159 | Contrôle de qualité | Essentiel pour la détection de la contamination par les mycoplasmes dans les cultures |
| Authentification des lignées cellulaires - humaines | 900154 | Contrôle de qualité | Vérifie l'identité des lignées cellulaires humaines |
Ce tableau représente une sélection de produits essentiels pour la culture de cellules de mammifères. Pour notre gamme complète de produits de culture cellulaire, y compris les milieux et réactifs spécialisés, veuillez consulter la page de la catégorie Milieux et réactifs.
Accutase est une solution de détachement cellulaire prête à l'emploi et filtrée de manière stérile, conçue comme une alternative douce à la trypsine/EDTA pour dissocier les cellules mammifères adhérentes des récipients en plastique standard pour culture tissulaire et des surfaces revêtues d'un agent d'adhérence. Elle combine une activité enzymatique protéolytique et collagénolytique dans une solution saline équilibrée pour offrir une dissociation efficace mais contrôlée, préservant les protéines de surface cellulaire et favorisant une viabilité élevée après passage ainsi qu'une réadhérence rapide.
La formulation d'Accutase est basée sur une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) avec de l'EDTA et du rouge de phénol comme indicateur visuel de pH. Les enzymes sont d'origine non mammifère et non bactérienne, ce qui rend Accutase particulièrement adapté à la recherche sur les cellules souches, aux processus de fabrication de vaccins et à toute application où les contaminants d'origine animale ou microbienne doivent être minimisés. La solution s'auto-inhibe à 37 °C ; aucun réactif neutralisant ni milieu contenant du sérum n'est donc nécessaire après le détachement – les cellules peuvent être transférées directement dans un milieu frais.
Caractéristiques principales
Liquide 1x stérilisé par filtration, prêt à l'emploi – aucune dilution ni reconstitution requise
Activité enzymatique combinée protéolytique et collagénolytique pour une dissociation en douceur
Chaque lot est standardisé à une activité de dissociation définie pour garantir la cohérence d'un lot à l'autre
Enzymes d'origine non mammifère et non bactérienne
S'auto-inhibe à 37 °C – aucune solution neutralisante n'est nécessaire
Formulé dans du PBS de Dulbecco avec de l'EDTA
Rouge de phénol inclus comme indicateur visuel de pH
pH 6,8 – 7,8
Applications typiques
Accutase dissocie en douceur une grande variété de types de cellules adhérentes et sensibles, notamment les cellules souches embryonnaires humaines (hESC), les cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC), les cellules souches neurales, les neurones primaires et les lignées adhérentes couramment cultivées telles que HeLa, HEK 293, CHO, MDCK, Vero, NIH/3T3, BHK-21 et A549. Exemples d'utilisation :
La sous-culture et le repiquage courants de cellules mammifères adhérentes
Dissociation douce de cellules individuelles issues de hESC, d'iPSC et d'autres lignées sensibles
Préparation d'échantillons pour la cytométrie en flux et l'analyse FACS
L'analyse des marqueurs de surface cellulaire où l'intégrité de l'épitope est cruciale
Tests de migration, de prolifération et d'apoptose cellulaires
Tests de quiescence par privation de sérum et études de transfection d'oncogènes
Tests de migration des cellules tumorales et des cellules de la crête neurale
Augmentation de la production dans les flux de travail en bioréacteur
Pour les travaux de routine, appliquez environ 10 ml d'Accutase par 75 cm² de surface de culture et incubez pendant 5 à 10 minutes à température ambiante. La durée d'incubation optimale doit être déterminée pour chaque lignée cellulaire et ne doit pas dépasser une heure. Avant l'ajout, rincez la couche cellulaire avec une solution saline exempte de Ca²⁺/Mg²⁺, telle que du DPBS sans calcium ni magnésium, afin d'éliminer le sérum résiduel et les cations divalents.
Manipulation et conservation
Conserver le flacon non ouvert congelé à -15 °C ou moins. Décongeler soit à température ambiante, soit pendant une nuit entre +2 °C et +8 °C. Ne pas décongeler Accutase dans un bain-marie à 37 °C, car les températures élevées réduisent l’activité enzymatique. Après décongélation, la solution peut être conservée jusqu’à 2 mois entre +2 °C et +8 °C ; ne pas conserver à température ambiante. Ne préchauffez pas le réactif à 37 °C avant utilisation – ajoutez-le directement aux cellules lavées à température ambiante. Pour une conservation à long terme, il est recommandé de prélever des aliquotes à usage unique afin d'éviter les cycles de décongélation répétés. Travaillez toujours dans des conditions aseptiques.
Qualité
Fabriqué selon des normes de qualité strictes. Chaque lot d'Accutase est filtré à stérilité et testé pour vérifier sa stérilité, son pH, son aspect et son activité de dissociation afin de garantir des performances constantes et reproductibles d'un lot à l'autre.
Spécifications du produit
Spécifications
Détails
Type de produitRéactif de détachement/dissociation cellulaire
FormatLiquide filtré stérile, prêt à l'emploi
Volume100 ml
Concentration d'utilisation1x (prêt à l'emploi)
Activité enzymatiqueProtéolytique et collagénolytique combinées
Origine de l'enzymeNon mammifère et non bactérienne
Système tamponPBS de Dulbecco avec EDTA
Indicateur de pHRouge de phénol
Plage de pH6,8 – 7,8
AspectSolution limpide, de couleur rouge pâle à orange
Température de stockage-15 °C ou moins
Stabilité après décongélationJusqu'à 2 mois entre +2 °C et +8 °C
Volume d'utilisation recommandé~10 ml par 75 cm² de surface de culture
Durée d'incubation typique5 à 10 minutes à température ambiante
Conditions d'expéditionCongelé dans de la glace carbonique
Utilisation prévueÀ usage exclusif pour la recherche et la fabrication ultérieure
Formulation (composition par litre)
Composant
Concentration (mg/L)
Sels inorganiques
Chlorure de sodium (NaCl)8000,00
Hydrogénophosphate disodique (Na₂HPO₄)1150,00
Chlorure de potassium (KCl)200,00
Dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄)200,00
Autres composants
EDTA · 4Na (EDTA tétrasodique)220,00
Rouge de phénol3,00
Mélange enzymatique exclusif (activité protéolytique et collagénolytique)1x
Accutase est une marque déposée d'Innovative Cell Technologies, Inc.
La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est une solution tampon largement utilisée dans la recherche biologique et chimique. Elle joue un rôle crucial dans le maintien de l'équilibre du pH et de l'osmolarité au cours de diverses procédures expérimentales, y compris le traitement des tissus et la culture cellulaire. Notre solution PBS est méticuleusement formulée avec des ingrédients de haute pureté afin de garantir la stabilité et la fiabilité de chaque expérience. L'osmolarité et les concentrations d'ions de notre PBS imitent étroitement celles du corps humain, ce qui la rend isotonique et non toxique pour la plupart des cellules.
Composition de notre solution PBS
Notre solution PBS est un mélange de tampons phosphatés et de solutions salines de qualité supérieure dont le pH est ajusté. À une concentration de travail de 1X, elle contient :
8000 mg/L de chlorure de sodium (NaCl)
200 mg/L Chlorure de potassium (KCl)
1150 mg/L phosphate de sodium dibasique anhydre (Na2HPO4)
200 mg/L Phosphate de potassium monobasique anhydre (KH2PO4)
Cette composition assure un pH et un équilibre ionique optimaux, convenant à une large gamme d'applications biologiques.
Applications de notre solution PBS
Notre solution PBS est idéale pour diverses applications dans la recherche biologique. Ses propriétés isotoniques et non toxiques la rendent appropriée pour la dilution de substances et le rinçage de récipients cellulaires. Les solutions PBS contenant de l'EDTA sont efficaces pour désengager les cellules attachées et agglutinées. Cependant, les métaux divalents tels que le zinc ne doivent pas être ajoutés au PBS, car ils peuvent provoquer une précipitation. Dans ce cas, les tampons Good's sont recommandés. En outre, notre solution PBS est une alternative acceptable au milieu de transport viral pour le transport et le stockage des virus à ARN, y compris le SARS-CoV-2.
Contrôle de la qualité
Filtré stérilement
Stockage et durée de conservation
Stocker entre +2°C et +25°C, à l'abri de la lumière.
Après ouverture, conserver entre 2°C et 25°C et utiliser dans les 24 mois.
Conditions d'expédition
Température ambiante
Entretien
Conserver au réfrigérateur entre +2°C et +8°C à l'abri de la lumière. Éviter la congélation et le réchauffement fréquent jusqu'à +37°C, car cela réduit la qualité du produit.
Ne pas chauffer le milieu au-delà de 37°C ou utiliser des sources de chaleur non contrôlées telles que les micro-ondes.
Si une partie seulement du milieu doit être utilisée, prélever la quantité nécessaire et la réchauffer à température ambiante avant de l'utiliser.
Composition
Catégorie
Composants
Concentration (mg/L)
Sels
Chlorure de potassium
200
Phosphate de potassium monobasique anhydre
200
Chlorure de sodium
8000
Phosphate de sodium dibasique anhydre
1150
Méthode d'analyse
CLS propose des tests à court et à long terme pour la détection des mycoplasmes. Dans le premier cas, les échantillons sont testés immédiatement après leur arrivée, tandis que dans le second, une culture cellulaire est mise en place et les cellules sont testées après 14 jours de culture sans antibiotiques. Les tests de détection des mycoplasmes sont effectués à l'aide d'un système de détection à deux points avec le PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) et le Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Échantillons
Pour le test rapide, veuillez fournir un minimum de 50 µl de suspension cellulaire contenant 50 000 cellules. La suspension cellulaire peut être expédiée à température ambiante.
Pour le test premium, veuillez fournir un minimum de 1 million de cellules dans un milieu de congélation approprié afin de garantir une culture robuste et saine pour la culture et le test ultérieur des cellules. Les échantillons doivent être expédiés sur de la glace sèche.
Veuillez remplir le formulaire d'échantillon pour le test des mycoplasmes et le joindre à votre envoi d'échantillons.
Test de rapporteur colorimétrique
Ce test est un essai colorimétrique sur cellules. En présence de mycoplasmes, une lignée de cellules rapporteuses induit une cascade de signalisation qui déclenche un changement de couleur dans le milieu, du rouge au bleu. L'essai est réalisé dans des plaques multipuits à 96 puits. Les signaux sont détectés dans un spectrophotomètre de microplaque à 620-655 nm. Toutes les espèces de mycoplasmes et d'acholeplasmes, mais aussi d'autres contaminants de la culture cellulaire tels que les bactéries, sont détectées.
Amplification isotherme
L'amplification isotherme est un test rapide et fiable basé sur l'amplification isotherme de l'ADN spécifique des mycoplasmes combinée à une détection en temps réel à l'aide d'un colorant intercalant l'ADN. Le test est capable de détecter six des espèces les plus courantes qui représentent plus de 95 % des contaminations : M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis et A.laidlawii. En raison de l'homologie des séquences, d'autres espèces de mycoplasmes seront également détectées (M.pneumoniae, M.gallisepticum et M.synoviae). Pour déterminer si l'échantillon est positif ou négatif à l'égard des mycoplasmes, la température de fusion (Tm) est étudiée.
Conclusion : Le rôle essentiel de la culture de cellules de mammifères dans la recherche moderne
La culture de cellules de mammifères a révolutionné la recherche biologique et médicale, en fournissant aux scientifiques des outils puissants pour étudier des processus cellulaires complexes, des mécanismes pathologiques et des interventions thérapeutiques potentielles. De l'isolement des cellules primaires au développement de lignées cellulaires immortalisées, cette technique est devenue un élément indispensable de la boîte à outils scientifique moderne
L'aventure de la culture de cellules de mammifères commence par des techniques d'isolement minutieuses, se poursuit par le maintien méticuleux des cellules dans des milieux spécialisés et se termine par un large éventail d'applications dans divers domaines d'étude. Qu'il s'agisse de recherche sur le cancer, de découverte de médicaments ou de biologie cellulaire fondamentale, la possibilité de cultiver et de manipuler des cellules de mammifères in vitro a ouvert des voies sans précédent à l'exploration scientifique
La clé du succès de la culture de cellules de mammifères réside dans les conditions soigneusement contrôlées dans lesquelles les cellules sont maintenues. De la composition des milieux de croissance aux paramètres environnementaux précis des incubateurs, chaque aspect est optimisé pour reproduire le plus fidèlement possible les conditions naturelles des cellules. Ce souci du détail garantit la fiabilité et la reproductibilité des expériences, pierre angulaire des bonnes pratiques scientifiques
Le développement de lignées cellulaires immortalisées, telles que les cellules HeLa, largement utilisées, a encore élargi les possibilités de la culture cellulaire. Ces lignées cellulaires fournissent des modèles cellulaires cohérents et facilement accessibles qui ont accéléré la recherche dans de nombreuses disciplines
Pour l'avenir, la culture de cellules de mammifères continue d'évoluer. Les progrès des techniques de culture en 3D, le développement d'organoïdes et l'utilisation de milieux chimiquement définis repoussent les limites de ce qui est possible en matière de culture cellulaire. Ces développements promettent de rapprocher les modèles in vitro de la complexité des systèmes in vivo, ce qui pourrait révolutionner la découverte de médicaments, la médecine personnalisée et notre compréhension de la biologie humaine
En conclusion, la culture de cellules de mammifères reste une technique dynamique et essentielle dans la recherche en sciences de la vie. Son perfectionnement et son application continus joueront sans aucun doute un rôle crucial dans la résolution de certaines des questions les plus pressantes en biologie et en médecine, stimulant ainsi le progrès scientifique pour les années à venir