Lentiviraalisten vektoreiden tuottaminen HEK293T-soluilla
Lentiviraalivektoreista on tullut keskeisiä välineitä nykyaikaisessa molekyylibiologiassa, geeniterapiassa ja solutekniikassa. Cytionilla olemme optimoineet protokollat korkean titterin lentivirusvektoreiden tuottamiseksi käyttämällä korkealaatuisia HEK293T-solujamme, jotka on erityisesti suunniteltu tehokkaaseen transfektioon ja virustuotantoon. Tässä kattavassa oppaassa käydään läpi hyväksi todettu protokolla korkealaatuisten lentivirusvektoreiden tuottamiseksi tutkimustarpeisiisi.
| Parametri | Suositus |
|---|---|
| Optimaalinen solulinja | HEK293T-solut (passage 5-20 parhaiden tulosten saavuttamiseksi) |
| Solujen konfluenssi transfektiohetkellä | 70-80% |
| Transfektiomenetelmä | Kalsiumfosfaatti- tai PEI-pohjainen transfektio |
| Vektorin keräysaika | Ensimmäinen sadonkorjuu: 48 tuntia transfektion jälkeen Toinen korjuu: 72 tuntia transfektion jälkeen |
| Odotettu titterialue | 106-108 TU/ml (konsentroimaton) |
Johdatus lentiviraalivektoreihin ja HEK293T-soluihin
HIV-1:stä peräisin olevilla lentivirusvektoreilla on useita etuja geenien siirtoon, kuten kyky integroitua sekä jakautuviin että jakautumattomiin soluihin, pitkäaikainen vakaa ilmentyminen ja suhteellisen suuri pakkauskapasiteetti. Näiden vektoreiden tuotanto perustuu suurelta osin HEK293T-soluihin, jotka ilmentävät SV40 large T -antigeenia, mikä mahdollistaa SV40-replikaatioperustan sisältävien plasmidien episomaalisen replikaation. Optimaalisen virustuotannon varmistamiseksi suosittelemme käyttämään HEK293T-soluja 5-20-vaiheiden välillä, sillä tämän alueen ulkopuolella olevat solut saattavat heikentää transfektiotehokkuutta ja vähentää virustuotosta.
Solukonfluenssi: Kriittinen tekijä onnistuneen transfektion kannalta
Oikean solutiheyden saavuttaminen transfektiohetkellä on kriittinen tekijä onnistuneen lentiviraalituotannon kannalta. Olemme jatkuvasti havainneet, että HEK293T-solujen pitäisi olla 70-80 %:n konfluenssissa transfektointihetkellä. Tässä tiheydessä solut ovat logaritmisessa kasvuvaiheessa, mikä optimoi sekä transfektion tehokkuuden että myöhemmän virustuotannon. Alhaisempi konfluenssi voi johtaa suboptimaaliseen saantoon, kun taas liian tiheät viljelmät johtavat usein solujen terveyden heikkenemiseen, transfektiotehokkuuden vähenemiseen ja alhaisempiin virustittereihin. Tavalliselle 10 cm:n lautaselle suositellaan kylvettäväksi 5-6 × 10⁶ solua 24 tuntia ennen transfektiota optimaalisen tiheyden saavuttamiseksi.
Oikean transfektiomenetelmän valitseminen
Lentiviraaliplasmidien siirtämiseksi HEK293T-soluihin suosittelemme joko kalsiumfosfaattisaostusta tai polyetyleenimiini- (PEI) transfektiomenetelmää. Molemmat menetelmät ovat osoittautuneet erittäin tehokkaiksi laboratorioissamme; kalsiumfosfaatti on perinteinen valinta ja PEI tarjoaa kustannustehokkaamman vaihtoehdon tehokkuudesta tinkimättä. Kalsiumfosfaattimenetelmä erottuu edukseen sen hellävaraisen vaikutuksen ansiosta solujen elinkelpoisuuteen, kun taas PEI:llä saavutetaan yleensä hieman korkeampi transfektioprosentti käsissämme. Ensikertalaisille käyttäjille suosittelemme aloittamaan PEI-menetelmällä, jossa DNA:PEI-suhde on 1:3, koska se antaa yleensä enemmän anteeksi tekniikan vaihteluita ja tuottaa silti erinomaisen virustuoton.
Vektorien keruun optimaalinen ajoitus
Lentiviraalivektorien keräämisen ajoitus vaikuttaa merkittävästi sekä saantoon että laatuun. Laajat testimme HEK293T-soluilla osoittavat, että kahden keruun lähestymistapa maksimoi virustuotannon. Suosittelemme ensimmäisen keruun suorittamista 48 tuntia transfektion jälkeen, kun virustuotanto on saavuttanut huomattavan tason mutta ennen kuin solukuolema on merkittävä. Kun väliaine on kerätty ja vaihdettu huolellisesti, toinen sadonkorjuu 72 tuntia transfektion jälkeen kerää tänä aikana tuotetut ylimääräiset virushiukkaset. Tämä peräkkäinen keräysstrategia lisää kokonaistuotosta tyypillisesti 30-50 prosenttia verrattuna yhteen keräykseen ilman, että vektorin laatu kärsii. Aikaa vaativissa sovelluksissa pelkkä 48 tunnin sadonkorjuu riittää yleensä useimpiin kokeellisiin tarpeisiin.
Odotetun titterin vaihteluväli ja saannon optimointi
Optimoitua protokollaamme noudattamalla konsentroimattomilla lentiviraalivalmisteilla saadaan tyypillisesti tittereitä, jotka vaihtelevat välillä106-108 transdusoivaa yksikköä millilitrassa (TU/ml), riippuen erityisestä siirtovektorista ja kohdesolutyypistä. Suurempia pitoisuuksia vaativissa sovelluksissa ultrasentrifugointi tai PEG-saostus voi nostaa titterit 100-1000-kertaisiksi. Saannon maksimoimiseksi suosittelemme, että elatusainetta täydennetään transfektion jälkeen natriumbutyraatilla (10 mM), joka voi lisätä virustuotantoa estämällä histonideasetylaaseja ja edistämällä transkriptiota viruspromoottoreista. Lisäksi inkubaatiolämpötilan laskeminen 32-34 °C:een keräysvaiheen aikana voi edelleen lisätä tuottoa hidastamalla viruksen hajoamista ja ylläpitämällä samalla tuotantoa. Näiden optimointien ansiosta HEK293T-solumme tuottavat jatkuvasti korkealaatuisia virusvalmisteita, jotka soveltuvat vaativimpiinkin sovelluksiin.