Ihmisen primaarisolut

Mitä ovat ihmisen primaarisolut?

Primaarisolut edustavat kunkin kudoksen puhtaimmassa muodossa. Ne eristetään kudoksesta ja käsitellään siten, että ne voivat vakiintua viljelyolosuhteissa, joissa vallitsevat ihanteelliset olosuhteet. Ne jäljittelevät tarkemmin in vivo -tilaa ja osoittavat normaalia fysiologiaa, koska ne on peräisin kudoksesta eivätkä ole muunneltuja. Tästä syystä ne voivat toimia hyödyllisinä malleina solufarmakologian, toksikologian ja fysiologian tutkimuksessa (mukaan lukien aineenvaihdunnan, ikääntymisen ja signaalinsiirron tutkimukset). On syytä muistaa, että primaarisolujen viljely ja ylläpito on haastavampaa kuin jatkuvan solulinjan, koska niiden elinikä on lyhyempi ja ne lakkaavat jakautumasta (eli ikääntyvät) tietyn määrän solujakautumisten jälkeen. Solujen signalointireittien tutkimusta vaikeuttaa luovuttajilta hankittujen primaarisolujen luontainen vaihtelevuus sekä aliviljelykäytännöt. Ennen signalointitutkimusten aloittamista tutkijat suorittavat usein seulonnan selvittääkseen, reagoivatko solut yleisesti käytettyihin ärsykkeisiin. Ajan ja rahan tuhlaamisen välttämiseksi primaarisoluja voidaan stimuloida aktivoimaan tärkeimmät signalointireitit ennen seulontaa.

Miksi käyttää ihmisen primaarisoluja?

Ikuistettuja solulinjoja käytetään yleisesti solutesteissä. Tutkijat ovat kuitenkin tunnustaneet, että solulinjoista johtuvat biologiset muutokset voivat haitata niiden fysiologisen merkityksen tutkimista. Ihmisen primaarisolujen käyttö parantaa soluviljelmistä saatujen tietojen fysiologista arvoa, ja niitä pidetään yhä tärkeämpinä biologisten prosessien, sairauksien etenemisen ja lääkekehityksen tutkimuksessa.

Ihmisen primaarisoluja käytetään laajalti solujen välisen ja solunsisäisen viestinnän in vitro -tutkimuksissa, kehitysbiologiassa sekä syövän, Parkinsonin taudin ja diabeteksen taustalla olevien mekanismien tutkimuksessa, samoin kuin monilla muilla prekliinisillä ja tutkimuksellisilla biologian tutkimusalueilla. Tutkijat ovat jo pitkään käyttäneet ikuistettuja solulinjoja kudosten toiminnan tutkimiseen; solulinjat, joissa on selviä mutaatioita ja kromosomipoikkeavuuksia, eivät kuitenkaan välttämättä ole hyviä korvikkeita normaaleille soluille tai taudin varhaisvaiheiden kehittymiselle. Tietyn kudoksen solutyypistä voidaan nyt saada tarkempi malli käyttämällä kyseisestä kudoksesta eristettyjä ihmisen primaarisoluja, joita ylläpidetään primaarisoluviljelyalustoilla ja lisäaineilla.

Mitä primaarisoluviljely on?

Ikuistettujen solulinjojen sijaan primaarisoluviljelyssä soluja kasvatetaan suoraan monisoluorganismista kehon ulkopuolella. Joissakin maissa, kuten Isossa-Britanniassa, on lainsäädännöllisesti tunnustettu, että primaarisoluviljelmät edustavat in vivo -kudoksia paremmin kuin solulinjat. Primaarisolut tarvitsevat kuitenkin kasvuaan varten oikean substraatin ja ravinteita, ja tietyn jakautumismäärän jälkeen niihin kehittyy ikääntynyt fenotyyppi, joka saa ne lopettamaan jakautumisen pysyvästi. Nämä kaksi tekijää ovat syynä solulinjojen luomiseen. Sekä luonnollisesti ikuistettuja primaarisoluja (esim. HeLa-solut) että keinotekoisesti ikuistettuja primaarisoluja (esim. HEK-solut) voidaan viljellä soluviljelyssä loputtomiin.

Ihmisen primaarisolut kudoslajeittain

Epiteelisolut, fibroblastit, keratinosyytit, melanosyytit, endoteelisolut, lihassolut, immuunisolut sekä mesenkymaaliset kantasolut kuuluvat tieteellisissä tutkimuksissa yleisimmin käytettyihin ihmisen primaarisoluihin. Alun perin viljelmät ovat heterogeenisiä (ne edustavat kudoksessa esiintyvien solutyyppien sekoitusta), ja niitä voidaan pitää elossa in vitro vain tietyn ajan. Transformaatio on in vitro -prosessi, jonka avulla ihmisen primaarisoluja voidaan manipuloida rajattomien aliviljelmien tuottamiseksi. Transformaatio voi tapahtua luonnollisesti tai sen voi indusoida kemikaaleilla tai viruksilla. Geneettisen transformaation jälkeen primaariviljelmä voi jakautua loputtomasti kuolemattomaksi sekundaariseksi solulinjaksi, jos sille annetaan riittävästi ravinteita ja tilaa.

Endoteelisolut

Syövän hoito, haavojen paraneminen, solusignaloinnin tutkimus, suurikapasiteettinen ja sisältörikas seulonta sekä toksikologinen seulonta ovat vain joitakin aloja, jotka voivat hyötyä primaaristen endoteelisolujen käytöstä tutkimusvälineenä.

Keratinosyytit

Keratinosyytit, jotka on peräisin joko aikuisen ihmisen ihon epidermiksestä tai vastasyntyneen esinahan ihosta, ovat keskeisessä roolissa ihosairauksien, kuten psoriasiksen ja syövän, tutkimuksessa.

Epiteelisolut

Syöpätutkimuksista toksikologisiin tutkimuksiin primaariset epiteelisolut ovat osoittautuneet korvaamattomiksi resursseiksi kehon luonnollisten puolustusmekanismien mallintamisessa.

Fibroblastit

Indusoidut pluripotentit kantasolut (iPS-solut) ja haavan paranemisen tutkiminen ovat vain muutamia primaaristen fibroblastien monista käyttötarkoituksista.

Immuunisolut

Perifeerisen veren mononukleaariset solut, lyhennettynä PBMC, ovat veressä esiintyviä mononukleaarisia soluja, joilla on pyöreä solutuma. Niihin kuuluvat pääasiassa lymfosyytit ja monosyytit, joilla on tärkeitä tehtäviä immuunivasteen kulussa. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja käytetään usein infektioiden diagnosointiin tai mahdollisen rokotussuojan havaitsemiseen. T-solujen välittämän soluvälitteisen immuunivasteen ymmärtäminen on usein ratkaisevan tärkeää.

Melanosyytit

Melanosyytit, eli pigmenttiä melaniinia tuottavat erikoistuneet ihosolut, ovat hyödyllisiä malleja tutkimuksessa, joka koskee esimerkiksi haavan paranemista, toksisuutta, melanoomaa, ihon reaktiota ultraviolettisäteilyyn (UV), ihosairauksia ja kosmetiikkaa.

Kantasolut

Kantasoluilla on potentiaalia erilaistua monenlaisiksi solutyypeiksi. Erilaistumiskykynsä ansiosta ne tarjoavat uusia mahdollisuuksia ihmiskudosten ja terveydentilojen mallintamiseen.

Mesenkymaaliset kantasolut

Mesenkymaalisia kantasoluja, joita kutsutaan myös MSC-soluiksi, voidaan saada erilaisista ihmisperäisistä lähteistä, kuten luuytimestä, rasvasta (rasvakudoksesta), napanuorakudoksesta (Whartonin hyytelöstä) ja sikiönvesistä (sikiötä ympäröivästä nesteestä), ja niitä voidaan lisätä in vitro. Näillä aikuisilla stromaalisilla kantasoluilla on kyky kehittyä monenlaisiksi solutyypeiksi. Tällaisia solutyyppejä ovat muun muassa luusolut, rusto- ja lihassolut, hermosolut, ihosolut sekä sarveiskalvosolut.

Sileät lihassolut

Onteloelimiä sisällä primaariset sileälihassolut (SMC) vuorovat elimen sisäpintaa ja välittävät supistumiskykyä. Syövän ja muiden sairauksien lisäksi sileälihassoluja voidaan käyttää hypertensiofibroosin mallintamiseen.

Primaarisolut ja solulinjat

Joko spontaanin mutaation kautta, kuten transformoiduissa syöpäsolulinjoissa, tai tarkoituksellisen muuntamisen kautta, kuten syöpägeenien keinotekoisessa tuotannossa, jatkuvat solulinjat ovat saaneet kyvyn lisääntyä loputtomasti (ikuistettuina). Yleensä jatkuvat solulinjat ovat luotettavampia ja helpompia käsitellä kuin primaarisolut. Niitä voidaan lisätä rajattomasti, ja ne tarjoavat nopean pääsyn olennaisiin tietoihin. Jatkuvien solulinjojen käytöllä on tiettyjä rajoituksia, kuten se, että ne ovat geneettisesti muunnettuja/transformoituja, mikä saattaa muuttaa fysiologisia ominaisuuksia ja poiketa in vivo -olosuhteista, ja että tämä voi muuttua edelleen ajan myötä merkittävien viljelykertojen myötä.

Edistysaskeleet primaarisoluviljelyssä

Primaarisoluilla on pahamaineinen maine vaikeasti käsiteltävinä. Prosessi on kuitenkin muuttumassa helpommaksi kuin koskaan aiemmin primaarisoluviljelyn kehityksen, täysin optimoitujen protokollien mukana saatavien kaupallisten primaarisolujen saatavuuden sekä vähemmän panostusta vaativien uusien analyysitekniikoiden ansiosta.

Siirtyminen kaksiulotteisesta kolmiulotteiseen soluviljelyyn katsotaan alan merkittäväksi virstanpylvääksi. Kudoskohtainen rakenne, solujen väliset vuorovaikutukset sekä mekaaniset ja biokemialliset signaalit voivat heikentyä kaksiulotteisessa viljelyssä. Näin ollen näiden viljelmien biologisella arvolla on rajansa.

Toisaalta kolmiulotteinen soluviljely mahdollistaa solujen lisääntymisen ja vuorovaikutuksen kolmiulotteisen solunulkoisen rakenteen kanssa. Tämä antaa soluille mahdollisuuden olla vuorovaikutuksessa keskenään ja solunulkoisen matriisin kanssa, mikä tekee kolmiulotteisista viljelmistä fysiologisesti merkityksellisempiä. Tämän menetelmän tarkkuus in vivo -vasteiden ennustamisessa on tehnyt siitä mullistavan esimerkiksi lääkekehityksessä ja -tutkimuksessa. Tämän vuoksi uusimmat teknologiat, kuten potilaista peräisin olevat organoidit ja ”organs-on-a-chip” -mallit, tarjoavat erittäin kontekstuaalisia malleja lääkkeiden seulontaan ja kehittämiseen.

Primaarisolujen tuottaminen on pullonkaula primaariviljelyssä. Tämän ongelman ratkaisemiseksi tarvitaan yleensä suurempi kudosmäärä, jonka hankkiminen voi olla haastavaa. Parantunut analyyttinen herkkyys tarjoaa kuitenkin ratkaisun. Esimerkiksi tarvetta viljellä suuria määriä primaarisoluja voidaan vähentää käyttämällä yksisoluteknologiaa, johon kuuluvat sekvensointi, western blotting ja massasytometria.

Lupaavat näkymät primaarisoluviljelylle

Teknologian kehitys lieventää primaarisoluviljelyn yleisiä vaikeuksia. Tämä menetelmä onkin nopeasti korvaamassa muut menetelmät solu- ja molekyylibiologian tutkimuksen ja käytännön kultaisena standardina. Rokotteiden valmistus, elinten korvaaminen, kantasoluterapiat, syöpätutkimus ja monet muut alat hyötyvät suuresti primaarisoluviljelyn jatkuvasta kehityksestä.

Vinkkejä ja neuvoja primaarisoluviljelyyn

Solujen lisäämisen tarpeet

Kaksi yleisintä menetelmää primaarisolujen viljelyyn ovat suspensio- tai pintaviljely (2D). Jotkut solut pystyvät kellumaan vapaasti verenkierrossa tarttumatta koskaan mihinkään pintaan (esimerkiksi perifeerisestä verestä peräisin olevat solut). Eri solulinjoja on muokattu menestymään suspensiokulttuureissa, joissa ne voivat saavuttaa tiheyksiä, joita ei voida saavuttaa 2D-kasvuolosuhteissa. Primaarisoluja, jotka tarvitsevat kiinnittymispinnan kasvaakseen in vitro, kutsutaan adheesiivisoluiksi, ja niihin kuuluvat kiinteissä kudoksissa esiintyvät solut. Adheesio-ominaisuuksien parantamiseksi ja kasvun sekä erilaistumisen kannalta välttämättömien signaalien toimittamiseksi näitä soluja viljellään tyypillisesti tasaisessa, päällystämättömässä muovisäiliössä, mutta toisinaan myös mikroalustalla. Jälkimmäinen vaihtoehto voidaan päällystää solunulkoisen matriisin proteiineilla (kuten kollageenilla ja laminiinilla). Soluviljelyssä käytettävä elatusaine koostuu perusliuoksesta, johon on lisätty tarvittavat kasvutekijät ja sytokiinit. Soluinkubaattori on erityinen laboratoriotyyppinen inkubaattori, jota käytetään solujen viljelyyn ja ylläpitoon tietyssä lämpötilassa ja kaasuseoksessa (tyypillisesti 37 °C, 5 % CO₂ nisäkässolujen osalta). Optimaaliset olosuhteet voivat vaihdella huomattavasti viljeltävän solutyypin mukaan. Viljeltävien solutyyppien mukaan optimaalisessa kasvualustassa on ainutlaatuinen tekijöiden yhdistelmä, johon kuuluvat muun muassa pH, glukoosipitoisuus, kasvutekijät ja muiden ravintoaineiden läsnäolo.

Kasvatusliuoksessa olevat antibiootit ovat ratkaisevan tärkeitä primaariviljelmän perustamisvaiheessa, jotta estetään kontaminaatio isäntäkudoksesta. Joissakin antibioottiohjelmissa käytetään gentamysiinin, penisilliinin, streptomysiinin ja amfoterisiini B:n yhdistelmää. Antibioottien pitkäaikaista käyttöä ei kuitenkaan suositella, koska jotkut aineet (kuten amfoterisiini B) voivat olla myrkyllisiä soluille pitkällä aikavälillä.

Useimmat primaarisolut käyvät läpi ikääntymisvaiheen ja lakkaavat jakautumasta tietyn määrän populaation kaksinkertaistumisten jälkeen, minkä vuoksi on ratkaisevan tärkeää pitää ne elossa eristämisen jälkeen. Solujen elinkelpoisuuden ylläpitäminen pitkällä aikavälillä vaatii ammattitaitoisia soluviljelytekniikoita ja ihanteellisia viljelyolosuhteita (mukaan lukien oikea elatusaine, oikea lämpötila, oikea kaasuseos, oikea pH, oikea kasvutekijöiden pitoisuus, ravinteiden läsnäolo ja glukoosin läsnäolo). Koska monet elatusaineiden täydennykseksi käytetyt kasvutekijät saadaan eläinten verestä (verestä peräisin olevat ainesosat voivat aiheuttaa kontaminaatiota), niiden käyttöä suositellaan rajoitettavaksi minimiin tai vältettäväksi kokonaan. On myös tärkeää noudattaa aseptista tekniikkaa.

Aliviljely ja ylläpito

Kun eristetyt solut kiinnittyvät viljelyastian pintaan, se merkitsee ylläpitovaiheen alkua. Kiinnittyminen tapahtuu tyypillisesti 24 tuntia viljelyn aloittamisen jälkeen. Solut tulisi siirtoviljellä, kun ne ovat saavuttaneet tietyn konfluenssiprosentin ja lisääntyvät aktiivisesti. Koska konfluenssin saavuttaneet solut voivat erilaistua ja niiden proliferaatio hidastua siirron jälkeen, on parasta siirtoviljellä primaarisoluviljelmiä ennen kuin ne saavuttavat 100 %:n konfluenssin.

Uudelleenviljely tuoreessa elatusaineessa ylläpitää kiinnittymisriippuvaisten solujen eksponentiaalista kasvua. Monokerrosten uudelleenviljely häiritsee solujen välisiä ja solunsisäisiä solupinnan vuorovaikutuksia. Pienipitoisia proteolyyttisiä entsyymejä, kuten trypsiiniä/EDTA:ta, käytetään kiinnittyneiden primaarisolujen erottamiseen monokerroksista tai kudoksista. Kun solut on irrotettu ja laimennettu yksisoluiseen liuokseen, ne lasketaan ja siirretään tuoreisiin viljelyastioihin kiinnittymään uudelleen ja lisääntymään.

Kryosäilytys ja palauttaminen

Kryosäilytys säilyttää elävät solut jäädyttämällä ne alhaisissa lämpötiloissa. Ihmisen primaarisolujen kryosäilytys ja sulatus estävät solukuoleman ja vaurioitumisen varastoinnin ja käytön aikana. Ihmisen primaarisolut kryosuojataan DMSO:lla tai glyserolilla (oikeassa lämpötilassa ja hallitulla jäätymisnopeudella). Jäädytysprosessin on tapahduttava asteittain, -1 °C minuutissa, jotta vältetään jääkiteiden muodostuminen. Pitkäaikainen säilytys edellyttää nestemäistä typpeä (-196 °C) tai alle -130 °C:n lämpötiloja.

Kryosäilöttyjen solujen sulattaminen onnistuu upottamalla jäädytetyt solut 37 °C:n vesihauteeseen noin 1–2 minuutiksi. Ihmisen primaarisoluja ei tule sentrifugoida pakastimesta sulatuksen jälkeen (koska ne ovat erittäin herkkiä vaurioille kryosäilytyksestä palautumisen aikana). Se sopii solujen levittämiseen välittömästi sulatuksen jälkeen ja edistää kiinnittymistä viljelmissä ensimmäisten 24 tunnin aikana levittämisen jälkeen. 1 Kun kryosäilötyt primaarisolut ovat kiinnittyneet, käytetty elatusaine on poistettava (koska DMSO on haitallista primaarisoluille ja voi aiheuttaa elinkelpoisuuden laskua sulatuksen jälkeen).