HuH7-rakud: sissejuhatus hepatoma ja HCV uurimisse

Inimese hepatomast pärinev HuH7 rakuliin on surematu kogum kasvajate tekitavaid epiteelilaadseid rakke. See liin koos selle derivaatidega HuH7.5 ja HuH7.5.1 on eksperimentaalsetes kontekstides praktiline asendus primaarhepatotsüütidele. Seda kasutatakse peamiselt rakukultuurimudelites C-hepatiidi viiruse (HCV) nakkuse ja hepatoma patofüsioloogia uurimiseks.

HuH7-rakkude päritolu ja omadused

Enne HuH7 rakuliini kasutamist teadustöös on oluline mõista selle päritolu, peamisi omadusi ja optimaalseid kasvatustingimusi.

HuH7 rakuliini lõid 1982. aastal Sato, J ja Nakabayshi, H, saades selle väga diferentseerunud hepatotsüütide vähirakuliinist. Algne allikas oli 57-aastase jaapani mehe hepatotsellulaarne kartsinoom. HuH7-rakud, mida iseloomustab võime toota mitmesuguseid füsioloogiliselt olulisi aineid, nagu albumiin ja alfa-fetoproteiin, on väga vastuvõtlikud HCV-nakkusele, mistõttu sobivad need kasutamiseks HCV-replikon-süsteemides. See omadus muudab rakuliini väärtuslikuks HCV-vastaste ravimite sõelumisel ja arendamisel. HuH7-rakud on epiteelilaadse morfoloogiaga, kuusnurkse kujuga ja kinnituvad kasvades pindadele, moodustades 2D-monokihid. HuH7-rakkude keskmine läbimõõt on 21,9 µm, neil on pigem suurem ja lamendunud välimus. HuH7 rakuliini iseloomustab heterogeenne kromosoomide arv, mis jääb tavaliselt vahemikku 55–63, mis peegeldab rakupopulatsiooni geneetilist variatiivsust. See heterogeensus on tingitud rakukultuuri käigus esinevast selektsioonisurvest ning võib varieeruda erinevates laboritingimustes.

Võrdlev analüüs: HuH7 vs. HuH7.5 rakuliinid

HuH7.5 rakuliin, mis on HuH7 derivaat, erineb peamiselt RIG-I (DDX58) geeni missense-mutatsiooni tõttu, mis on oluline rakusisese viirusevastase reaktsiooni jaoks. See mutatsioon suurendab HuH7.5 rakkude vastuvõtlikkust genoomse ja subgenoomse HCV RNA replikatsioonile, eristades seda emarakuliinist HuH7 viroloogilises uurimistöös kasutatavuse poolest.

HuH7-rakkude kasvatamine: optimaalse kasvu tagamiseks vajalikud juhendid

HuH7-rakud, mis on olulised paljudes teadusuuringutes, vajavad kasvamiseks täpseid kasvatustingimusi. Käesolevas osas käsitletakse HuH7-rakkude kasvatamise põhilisi aspekte, tagades nende füsioloogilise asjakohasuse säilimise teadusuuringutes.

Kaksinkordistumisaeg

HuH7-rakkude kahekordistumisaeg on tavaliselt 24 tundi, kuigi erinevused rakukultuurikeskkonnas võivad seda perioodi pikendada 36–48 tunnini, mis rõhutab keskkonnatingimuste mõju rakkude paljunemisele.

Adhesiooni omadused

HuH7-rakud moodustavad peamiselt kahemõõtmelise monokihi, kinnitudes kultuuriplaatide ja kolvide pindadele, mis rõhutab nende eelistust stabiilse füüsilise substraadi suhtes suspensioonikultuuride ees.

Optimaalne külvitihedus

HuH7-rakkude konfluentsuse hoidmine vahemikus 30–90% on kriitilise tähtsusega, et vältida proliferatsioonimäära langust konfluentsuse ületamisel 90%. Subkultiveerimine accutase'iga hõlbustab rakkude eraldumist, võimaldades külvamist eksperimendi vajadustele kohandatud tihedustega, ulatudes optimaalsest (2×10⁴ rakku/cm²) kuni küllastumiseni (6×10⁴ rakku/cm²).

Toitainete vajadused

Kõrge glükoosisisaldusega Dulbecco modifitseeritud Eagle'i keskkond (DMEM), millele on lisatud 10% loote veise seerumit (FBS), pakub HuH7 rakkudele ideaalset toitumiskeskkonda. Regulaarsed keskkonna uuendused, ideaalis 2–3 korda nädalas, on olulised rakkude tervise säilitamiseks.

Keskkonnatingimused

Niisutatud inkubaator, mis on seadistatud 5% CO₂ ja 37 °C-le, toetab optimaalselt HuH7 rakukultuuri, simuleerides rakkude tegevusele soodsaid füsioloogilisi tingimusi.

Pikaajaline säilitamine

Pikemaajaliseks säilitamiseks tuleks HuH7 rakke hoida vedela lämmastiku aurufaasis, tagades nende eluvõimelisuse tulevasteks uuringuteks.

Krüokonserveerimine ja taastamine

Järkjärgulise külmutamise tehnika kasutamine on ülioluline rakkude eluvõimelisuse säilitamiseks krüokonserveerimise ajal. Rakud tuleks suspendeerida spetsiaalselt selleks loodud külmutuskeskkonnas, näiteks CM-1, tagades sujuva ülemineku krüogeensele säilitamisele. Sulatamisel on rakukultuuride taastamiseks oluline kiire, kuid õrn taaselustamine 37 °C veevannis, millele järgneb tsentrifuugimine külmutusvedeliku eemaldamiseks ja uuesti suspendeerimine värskes kasvukeskkonnas.

Bioloogilise ohutuse kaalutlused

HuH7 rakuliini käitlemisel ja paljundamisel on soovitatav järgida 1. taseme bioloogilise ohutuse protokolli, mis on kooskõlas laboratoorsete ohutus- ja eetikastandarditega.

Nende hoolikalt kirjeldatud kultiveerimistingimuste järgimisega saavad teadlased tagada HuH7-rakkude tugeva kasvu ja füsioloogilise asjakohasuse oma teaduslikes uuringutes, sillutades teed murrangulistele avastustele hepatoma ja C-hepatiidi viiruse uurimisel.

Avasta HuH7-rakke oma teaduslike läbimurrete jaoks

HuH7-rakud: eelised ja puudused

HuH7 rakuliinil on nii eeliseid kui ka piiranguid. Vaatame läbi selle rakuliini võimalikud plussid ja miinused, sest see võib aidata teil otsustada, kas see sobib teie katseteks.

HuH7 rakuliini eelised

HuH7 rakkudel on palju iseloomulikke omadusi, mis muudavad need teadustööks atraktiivseks.

• Lihtne paljundamine: Erinevalt teistest inimese hepatoma rakuliinidest saab HuH7 rakuliini kergesti kasvatada ilma seerumi lisamiseta; CLS soovitab siiski kasutada RPMI 1640-t koos 10% FBS-i ja 2 mM L-glutamiiniga. HuH-7 rakud eritavad kasvufaktorit, mis aitab rakkudel kasvada ilma seerumita.
• Transfektsiooni paindlikkus: HuH7 rakuliini kasutatakse laialdaselt transfektsiooni eesmärgil, kuna see on väga vastuvõtlik HCV genoomile. Seetõttu on need rakud kesksel kohal HCV-vastaste ravimite sõelumisel ja arendamisel.
• Alternatiiv inimese hepatotsüütidele: HuH7 rakuliin on suurepärane asendus inimese hepatotsüütidele. See aitab teadlastel uurida maksa ravimtransporteerijaid ja mõista teatud ravimite koostoimet MRP-dega (multiravimresistentsusega seotud valgud).
• Ksenotransplantaadi hiiremudeli arendamine: HuH7 rakke on kasutatud rakuliinist pärineva ksenotransplantaadi hiiremudeli loomiseks. See loommudel võib anda teadlastele väärtuslikku teavet valk-kinaasi inhibiitorite ja vähivastaste ravimeetodite kohta.
• Vähktõve uurimine: HuH7 rakuliin on inimese maksavähirakkude liin, mis aitab teadlastel läbi viia maksavähktõve uuringuid.

HuH-7 rakuliini piirangud

HuH7 rakuliini kasvatamisega on seotud mõned piirangud.

Mikroobne saastumine: Bakteriaalne saastumine on rakukultuuris kõige levinum probleem. Kui tekib infektsioon, on seda võimalik eristada kultuurikeskkonna pH-muutuse ja hägususe järgi. Bakteriaalse saastumise hulgas ei ole mükoplasma saastumine tavaliselt silmaga nähtav. Siiski mõjutab see aeglaselt rakuliini morfoloogiat, geeniekspressiooni ja muid omadusi.

Kultiveerimisperiood: Kuigi HuH-7 rakuliin on surematu, võib kultiveerimisperioodi ületamine järk-järgult mõjutada rakkude tervist. See võib mõjutada proliferatsioonikiirust ja geeniekspressiooni, mis võib vähendada tulemuste reprodutseeritavust. HuH-7 rakuliini puhul tuleks passaažide arvu hoida alla 20–25.

HuH-7 rakkude rakendused

See inimese hepatomast pärinev rakuliin pakub palju uurimisvõimalusi. Siin kirjeldame mõningaid uurimisvaldkondi, kus kasutatakse HuH7 rakuliini.

1. Ravimresistentsus: HuH7 on hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC) rakuliin, mida saab kasutada potentsiaalsete maksavähi ravimite suhtes ravimresistentsuse uurimiseks. 2021. aastal läbi viidud uuringus kasutati HuH7 rakke, mis olid eksperimentaalselt muudetud sorafenibi suhtes resistentseks, et arendada uusi ja tõhusaid ravimeid, st mitokondritesse kogunevaid isekogunevaid peptiide.

2. Geneetilised teadmised ja molekulaarne profiilimine HuH7-rakkude abil: Erinevad HuH7-rakuliinid, sealhulgas mitmesugused derivaadid ja variandid, on võimaldanud sügavamalt mõista geeniekspressiooni ja konkreetsete genoomimarkerite rolli haiguses. Evgeny Gladilini ja teiste teadlaste poolt propageeritud tehnikaid, nagu Ramani spektroskoopia, on rakendatud HuH7-rakkude molekulaarsele ja rakulisele profiilimisele, paljastades teadmisi rakkude reaktsioonist viirusinfektsioonile. Raman-spektroskoopia potentsiaal koos selliste meetoditega nagu kvantitatiivne proteoomika on hõlbustanud pereraku reaktsioonide uurimist, sealhulgas interferoonireaktsiooni ja lipiiditilgakeste muutusi, mis on kriitilise tähtsusega HCV replikatsiooni ja SARS-i mõju mõistmisel. Erinevate onkogeensete markerite ekspressiooni saab uurida, et mõista nende käitumist vastusena mis tahes ravile, nagu näiteks uuringus, kus kasutati HuH7-rakke, et uurida kaempferooli ühendi mõju MMP9 ja AKT signaalitee geenide ekspressioonimustrile. Need signaaliteed reguleerivad hepatotsellulaarse kartsinoomi metastaase ja invasiivsust. Teises hiljutises uuringus uuriti ka Wnt/β-kateniini signaalikaskadi geeni rolli HCC-rakkude ellujäämises ja kasvus.

3. Ravimite arendamine: HuH7-rakke kasutatakse laialdaselt maksavähi ravimite sõelumisel ja arendamisel. On läbi viidud mitmeid uuringuid, et uurida paljude taimeekstraktide, taimepõhiste ühendite, nanokübide ja muude ravimite inhibeerivat potentsiaali HCC vastu. 2022. aastal läbi viidud uuringus uuriti radionukliidi proapoptootilisi ja vähivastaseid omadusi hepatotsellulaarse kartsinoomi vastu, kasutades HuH7 rakuliini.

4. HuH7-rakud: viiruseteaduse ja rakuanalüüsi keskpunkt HuH7-rakud on muutunud nurgakiviks viirusinfektsioonide ja nakkushaiguste, eriti C-hepatiidi viiruse (HCV) ning nende vastastikmõju uurimisel koronaviirustega, nagu SARS-CoV-2, mis põhjustab koronaviirushaigust 2019 (COVID-19). HuH7-rakke kasutavate eksperimentaalsete HCV-rakukultuuri süsteemide (HCVcc) arendamine on oluliselt edendanud meie võimet uurida HCV keerukat replikatsiooniprotsessi ja HCV-nakkusele olulisi peremeesfaktoreid. See hõlmab HCV RNA replikatsiooni efektiivsuse ja nakkavate viirionide tootmise uurimist. Erinevad HuH7-rakkude liinid, sealhulgas vananevad ja nakatunud variandid, pakuvad mitmekesist valikut SARS-i-taoliste viiruste nakatumise mitmekesisuse, viiruse leviku ja pärssemehhanismide uurimiseks.

Kokkuvõttes hõlmab HuH7-rakkude uurimine laia teaduslike küsimuste spektrit, alates viirusinfektsioone toetavatest molekulaarsetest mehhanismidest kuni nende patogeenide poolt esile kutsutud üksikasjalike rakuliste reaktsioonideni. HuH7-uuringute kaudu avastab teaduskogukond jätkuvalt peremees-viiruse interaktsioonide keerulist dünaamikat, aidates kaasa viirusevastaste strateegiate arengule ja meie arusaamisele viirushaiguste rakulistest determinantidest.

HuH-7-ga seotud publikatsioonid

On olemas arvukalt publikatsioone, milles kasutatakse HuH7 rakuliini erinevatel eesmärkidel. Siin oleme maininud mõned hiljutised ja olulised publikatsioonid.

• Mitokondritele suunatud isekogunevate peptiidide rakendamine uue ravimeetodina sorafeniibile resistentsete hepatotsellulaarse kartsinoomi rakkude puhul.

See uuring avaldati ajakirjas Nature Scientific Reports 2021. aastal. Uuringus kasutati eksperimentaalselt indutseeritud sorafeniibile resistentseid hepatotsellulaarse kartsinoomi rakke (HuH7 rakuliin), et uurida hiljuti arendatud Mito-FF (mitokondritesse kogunevad isekogunevad peptiidid) proapoptootilisi ja kasvajavastaseid toimeid.

• Kaempferool pärsib inimese hepatotsellulaarse kartsinoomi rakkude rännet, summutades MMP-9 ja Akt signaalimist

See artikkel avaldati ajakirjas Environmental Toxicology, autorid Po-Chung Ju ja kolleegid, 2021. aastal. Selles uuringus uurisid teadlased taimse ühendi kaempferooli metastaasivastast potentsiaali hepatotsellulaarse kartsinoomi rakkude (HuH7) suhtes. Lisaks uurisid nad ka signaalradasid, mis reguleerivad maksavähirakkude metastaase ja invasiivsust.

• Dafnetiin pärsib hepatotsellulaarse kartsinoomi rakkude ellujäämist, reguleerides Wnt/β-kateniini signaaliteed

See artikkel avaldati ajakirjas Drug Development Research 2022. aastal. Uuring selgitab daphnetiini ühendi vähivastast toimet HCC vastu. See taimset päritolu ühend pärsib Wnt/β-kateniini signaalimist, et piirata vähirakkude kasvu.

• RGFP966 pärsib kasvaja kasvu ja levikut, inhibeerides EGFR-i ekspressiooni hepatotsellulaarse kartsinoomi rakkudes in vitro

Ajakirjas „Drug Design, Development, and Therapy” avaldatud uurimistöö kirjeldab EGFR-signaalitee rolli hepatotsellulaarse kartsinoomi kasvu ja metastaaside tekkes. Uuringus kasutati HuH7-rakke, et uurida histoonide deatsetülaasi 3 (HDAC3) inhibiitori RGFP966 pärssivat mõju HCC-le EGFR-signaalitee geenide pärssimise kaudu.

• Reeniumperrenaat (188ReO4) indutseeris apoptoosi ja vähendas vähifenotüüpi maksavähirakkudes

Ajakirjas Cells avaldatud artikkel kirjeldab HuH7-rakkude kasutamist radionukliidi, st reeniumperrenaadi, HCC-vastase potentsiaali uurimisel.

• Kurkumiini sisaldavate kitosaani nanokübemete viirusevastane toime C-hepatiidi viiruse genotüübi 4a vastu inimese hepatoma rakuliinides

See uuring on avaldatud ajakirjas International Journal of Nanomedicine. Uuringus kasutati HuH7-rakke, et uurida kurkumiini sisaldavate kitosaani nanokübemete antiviiruslikku toimet HCV genotüübi 4a vastu.

HuH-7 ressursid: protokollid, videod ja muud

HuH7 rakuliini kasvatamiseks ja hooldamiseks on saadaval palju ressursse. Siit leiate teavet HuH7 rakuliini kasvatamise ja transfektsiooni protokollide selgitamiseks mõeldud ressursside ning õppevideote kohta.

Rakukultuuri protokollid

Järgmised ressursid aitavad teil alustada HuH7-rakkude kasvatamist ja hooldamist.

• HuH-7 rakukultuuri teave ja ressursid: Sellel veebisaidil on palju kasulikku teavet, sealhulgas HuH7 rakuliini subkultiveerimise protokoll, selle säilitamine ja käitlemine.

• HuH7 rakukultuuri protokoll

HuH7 transfektsiooniprotokollid

HuH7 rakke transfekteeritakse mitmel viisil. Järgmised allikad pakuvad rohkesti teavet transfektsiooniprotokollide, vajalike reagentide ja kemikaalide, kasulike näpunäidete ja ettevaatusabinõude kohta.

HuH7 rakuliiniga seotud videod

Saadaval on palju õppevideoid põhiliste subkultiveerimise, plaadistamise ja transfektsiooniprotokollide jms kohta.

• Rakkude passaažimine: rakukultuuri alused: see video käsitleb rakuliini põhilist kultiveerimisprotokoll.

Loodame, et käesolevas artiklis esitatud teave aitab teil omandada HuH7 rakuliini kohta põhiteadmisi ja edasijõudnud teadmisi enne sellega töötamist. Kui soovite neid rakke oma teadustöös kasutada, võite need meilt tellida.

Korduma kippuvad küsimused HuH7 rakuliini ja viiruseteaduse kohta